海綿由来の細胞毒性物質onnamide Aの作用機序に関する研究

• Project/Area Number: 14780468
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Bioorganic chemistry
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 濱田 季之 独立行政法人理化学研究所, タンパク質機能研究チーム, 研究員 (40321799)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2002: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: 海綿 / 細胞毒性物質 / 作用機序 / 標的タンパク質 / アフィニティークロマトグラフィ / 光親和性標識 / リボソーム / 細胞毒性 / 活性発現メカニズム / アフィニティーカラ / MALDI-TOF MS / 一次構造データベース / HeLa細胞

Research Abstract

海綿Theonella swinhoeiから単離された細胞毒性物質onnamide Aの作用機序を明らかにするため、その標的タンパク質を探索した。
まず、onnamide Aアフィニティークロマトグラフィーを用いた標的タンパク質の網羅的探索として、onnamide Aの直鎖状構造部分のカルボン酸を介してaminoalkyl agarose gelとstreptavidin gelにそれぞれ結合させた。タンパク質源としてHeLa細胞の細胞質画分を用い、標的タンパク質を精製したところ、SDS-PAGE上で十数種の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。それらのバンドは、アミノ酸N末シークェンス法やpeptide mass finger printing法により同定した。
次に、光親和性標識化合物(アフィライト-CHO)とonnamide Aを化学結合させ、それをプローブとして標的タンパク質を探索した。光親和性標識onnamide AをHeLa細胞の細胞質画分と80Sリボソーム画分のそれぞれと混合し、SDS電気泳動、続くウェスタンブロッテイング後にAP標識ストレプトアビジンを用いた化学発光により、細胞質画分では1種(50kDa)、80Sリボソーム画分からは数種(50kDa,35-40kDa,15kDa)の標的タンパク質に対応するバンドを検出した。これらのバンドについては、peptide mass finger printing法などを用いて同定を行なう予定である。
これまでの研究及び知見から、onnamide Aは、pederin同様、リボソームと相互作用していることが分かった。今後は、リボソーム画分からの標的タンパク質の探索、同定を進め、onnamide Aの作用機序について考察する予定である。