| Project/Area Number |
14780526
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Molecular biology
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
廣明 秀一 横浜市立大学, 大学院・総合理学研究科, 助教授 (10336589)
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| Project Period (FY) |
2002 – 2003
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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| Budget Amount *help |
¥4,100,000 (Direct Cost: ¥4,100,000)
Fiscal Year 2003: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2002: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
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| Keywords | ホスホリパーゼD / ホスファチジン酸 / エンドソーム / PX domain / ドメイン解剖学 / SH3 domain / MIT domain / PRESAT-vector / 脂質結合ドメイン / PXドメイン / PHドメイン / 人工シャペロン / タンパク質の巻き戻し |
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| Research Abstract |
本研究は、ヒトホスホリパーゼD(PLD)と代謝産物ホスファチジン酸(PA)のシグナル伝達機構を、構造生物学的に解明することが最終的な目的である。本課題では、(1)PLDの細胞内局在や活性を制御しているN末端領域から、単独でfoldingするドメインを単離し構造解析を行うドメイン解剖学的研究、(2)PLDシグナル経路下流に存在するエフェクターを同定する目的で新規PA結合ドメインの探索、(3)両者に共通するドメイン解剖学の基盤技術の開発を行った。その結果
(1)PLDのN末端に存在するPLD1-PXの発現系・巻き戻し条件を確立しNMR測定に成功した。PLD1-PXは溶解度が低く、部分的に非特異的に会合し、6割強のNMRシグナルしか観測できなかった。生化学的実験には十分な試料を得る方法が確立できた。今後、脂質結合特異性を決定する。
(2)2003年にJangらによりPLD2-PXとPLCγ1-SH3の相互作用のシグナル伝達における重要性が示された。類似のドメイン間相互作用系として、PLD2-PXよりも溶解度の高いp47PXとp47SH3Cを用いて、脂質結合の変化を調べた。PI(45)P_2との結合はSH3により阻害される一方、PAとの結合は阻害されなかった(論文1)
(3)新規膜結合ドメインを探索するために、それに適した発現系構築法(PRESAT-vector法)を開発し、MITドメインとPXAドメイン計9種類の発現実験を行った(論文2)。いずれもエンドソーム因子SNX中でPXに隣接して現れるドメインであり、PLD下流因子である可能性がある。現在、MITの一つにPIP結合活性があることを見出し、立体構造解析中である。
(4)ドメイン解剖学的手法の基盤として、溶解度の低い蛋白質ドメインのNMR解析法を開発した。GCMをモデル試料として実証実験を行い、その完全帰属に成功した(論文3)。
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