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阻害剤開発の基盤構築を目指した薬剤排出トランスポーターのX線結晶構造解析

Research Project

Project/Area Number 14J01576
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Structural biochemistry
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

林 克彦  大阪大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2014-04-25 – 2017-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help
¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
Fiscal Year 2016: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
KeywordsX線結晶構造解析 / 多剤排出トランスポーター / トランスポーター / 多剤耐性菌
Outline of Annual Research Achievements

多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現に関与する薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、以下の3つの課題に取組んだ。(1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析 2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析 3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーター MacBの結晶構造解析)
平成28年度は目標に対し次の事が明らかとなった。
1.MexY結晶を用いて大型放射光施設SPring 8で得たX線回折データから分子置換法で位相決定し、MexY構造を新たに決定することに成功した。しかしながら、この構造は薬剤認識・排出機能の議論をすることが難しいMexY単量体構造であった。そこで、より強固な三量体を構成するMexY変異体を作製し、このMexY変異体の薬剤耐性能および排出機能を保持することを確かめた。現在は、この変異体MexYの結晶化に取り組んでいる。
2.前年度までにリンカー配列を最適化した1:1構成比のAcrB-AcrA融合たんぱく質を用いた発現量活性相関から、融合たんぱく質がそれ単体で排出活性を有することを確かめた。AcrBとTolCの間では、システイン残基を適当な場所に導入すると生理的条件で直にジスルフィド架橋を形成する。AcrB-AcrA融合蛋白質でも同様に架橋が形成されることを確かめ、親和性タグでの精製を最適化し、架橋を持ったAcrAB-TolC複合体の精製法を確立した。精製した複合体をネガティブ染色と透過型電子顕微鏡により観察すると、大きさの揃った粒子が観測された。この三者複合体の構造決定を単粒子像再構成により目指している。
3.MacBの発現系を見直し、コムギ無細胞発現システムにより全長MacBを発現させた。リポソームに発現したMacBを用いて結晶化条件探索をしたが、結晶は得られていない。精製法、結晶化条件の検討を続け、構造解析可能な結晶の調製を目指す。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(3 results)
  • 2016 Annual Research Report
  • 2015 Annual Research Report
  • 2014 Annual Research Report
  • Research Products

    (13 results)

All 2016 2015 2014

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (11 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results)

  • [Journal Article] AcrB-AcrA Fusion Proteins That Act as Multidrug Efflux Transporters2015

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashia, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Kimie Kitagawa, Seiji Yamasaki, Kunihiko Nishino, and Akihito Yamaguchi
    • Journal Title

      Journal of Bacteriology

      Volume: 198 Issue: 2 Pages: 332-342

    • DOI

      10.1128/jb.00587-15

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Effect of methylglyoxal on multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.2014

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashi, Aiko Fukushima, Mitsuko Hayashi-Nishino, and Kunihiko Nishino
    • Journal Title

      frontiers in Microbiology

      Volume: 5 Pages: 180-180

    • DOI

      10.3389/fmicb.2014.00180

    • Related Report
      2014 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 大腸菌AcrB-AcrA融合タンパクの解析とAcrAB-TolC構成比の決定2016

    • Author(s)
      林 克彦、中島 良介、櫻井 啓介、北川 公惠、山崎 聖司、西野 邦彦、山口 明人
    • Organizer
      第136回日本薬学会年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜
    • Year and Date
      2016-03-27
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] Structural analysis of the complex of the AcrAB-TolC multidrug efflux system2016

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashi, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Kimie Kitagawa, Seiji Yamasaki , Kunihiko Nishino, and Akihito Yamaguchi
    • Organizer
      JSPS-DAAD Cooperative Project and Joint Seminar
    • Place of Presentation
      Institut fuer Lebensmittelqualiaet und sicherheit, Tieraerztliche Hochschule Hannover, Germany
    • Year and Date
      2016-02-23
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 大腸菌多剤排出トランスポーターAcrB-AcrA融合蛋白質の発現・解析と排出活性に必要な構成比の決定2015

    • Author(s)
      林 克彦、中島 良介、櫻井 啓介、北川 公惠、山崎 聖司、西野 邦彦、山口 明人
    • Organizer
      日本生体エネルギー研究会第41回討論会
    • Place of Presentation
      東京大学医学部1号館講堂
    • Year and Date
      2015-12-20
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] AcrB-AcrA融合蛋白質によるAcrAB-TolC機能複合体の構成比の決定2015

    • Author(s)
      林 克彦、中島 良介、櫻井 啓介、北川 公惠、山崎 聖司、西野 邦彦、山口 明人
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会第 88回日本生化学大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸国際展示場
    • Year and Date
      2015-12-02
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] AcrB-AcrA融合蛋白質によるAcrAB-TolC機能複合体の構成比の決定2015

    • Author(s)
      林 克彦、中島 良介、櫻井 啓介、北川 公惠、山崎 聖司、西野 邦彦、山口 明人
    • Organizer
      第71回産業科学研究所学術講演会
    • Place of Presentation
      大阪大学産業科学研究所
    • Year and Date
      2015-11-24
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] Stoichiometry of a Functional AcrA and AcrB Complex2015

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashi, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Kimie Kitagawa, Seiji Yamasaki , Kunihiko Nishino, and Akihito Yamaguchi
    • Organizer
      Gordon Research Conference (Multi-Drug Efflux Systems) 2015
    • Place of Presentation
      Renaissance Tuscany Il Ciocco, Lucca (Barga), Italy
    • Year and Date
      2015-04-26
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Stoichiometry of a Functional AcrA and AcrB Complex2015

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashi, Ryosuke Nakashima, Keisuke Sakurai, Kimie Kitagawa, Seiji Yamasaki , Kunihiko Nishino, and Akihito Yamaguchi
    • Organizer
      Gordon Research Seminar (Multi-Drug Efflux Systems) 2015
    • Place of Presentation
      Renaissance Tuscany Il Ciocco, Lucca (Barga), Italy
    • Year and Date
      2015-04-25
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] in vitro Reconstruction of Functional AcrAB-TolC Multidrug Efflux System2014

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashi
    • Organizer
      JSPS and DAAD International Joint Symposium
    • Place of Presentation
      Halle (Germany)
    • Year and Date
      2014-07-30
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] in vitro Reconstruction of Functional AcrAB-TolC Multidrug Efflux System2014

    • Author(s)
      Katsuhiko Hayashi
    • Organizer
      ISIR and INRA International Joint Symposium
    • Place of Presentation
      Nouzilly (France)
    • Year and Date
      2014-07-28
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] グラム陰性菌多剤排出トランスポーターの阻害剤結合構造2014

    • Author(s)
      林克彦、中島良介、櫻井啓介、山崎聖司、西野邦彦、山口明人
    • Organizer
      第12回 次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム
    • Place of Presentation
      箱根高原ホテル( 神奈川 )
    • Year and Date
      2014-07-14 – 2014-07-15
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] 第14回日本蛋白質科学会年会2014

    • Author(s)
      林克彦、中島良介、山崎聖司、櫻井啓介、北川公惠、西野邦彦、山口明人
    • Organizer
      第14回日本蛋白質科学会年会
    • Place of Presentation
      ワークピア横浜( 神奈川 )
    • Year and Date
      2014-06-25 – 2014-06-27
    • Related Report
      2014 Annual Research Report

URL: 

Published: 2015-01-22   Modified: 2024-03-26  

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