| Project/Area Number |
14J02640
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Functional biochemistry
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
堤 元佐 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2015)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2015: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Keywords | 転写調節因子 / 生物物理 / 国際情報交換 / 転写調節機構 / 生物物理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
引き続き、「生細胞内で発現された転写因子の段階的なDNA認識動態について、それらの拡散動態が生じるために必要な外的・内的環境条件を決定付けること」を目的とし、研究を進めた。
１．FMBP-1の超解像観察：前年度までの蛍光相関分光法（FCS）による解析から、細胞核内のFMBP-1の複数の拡散動態は、クロモソーマルDNAとの相互作用を反映すると示唆された。本年度は超解像顕微鏡によるさらなる解析を行った。蛍光標識を施したヒストン蛋白質H2BをEGFP-FMBP-1融合蛋白質と同時にHeLa細胞に発現させ、SIM顕微鏡を用いて観察した結果、野生型のFMBP-1とH2Bで明らかな共局在が見られた一方、DNA結合能欠損変異体FMBP-1とH2Bの分布が重ならないことが明示された。このことから、FMBP-1の相互作用相手が核内クロモソーマルDNAであることが確かめられた。
２．FCCSによる解離定数（Kd）の導出：前年度の研究で、細胞溶解産物（ライセート）中での蛍光相互相関分光法（FCCS）測定によってFMBP-1とDNAプローブの相互作用が定量可能なことが示された。本年度はこの研究をさらに進め、多種類のFMBP-1変異体とDNAプローブを組み合わせて滴定実験を行い、Kdを算出した。野生型FMBP-1と認識配列DNAプローブ間のKdは数百nMと算出された一方、DNA結合ドメイン欠損変異体では有意な相互作用は見られず、少なくとも10 μM以上の高いKdが推定された。これらの実験の結果から、FMBP-1のDNA結合能の配列特異性が初めて定量的に示された。
３．海外研究所における短期訪問研究：本年度はスウェーデン・カロリンスカ研究所に短期滞在し、同所にて開発中の多点同時FCS解析装置によるFMBP-1の拡散動態観察を試みた。現地の研究員と協力して実験系を立ち上げ、多くの測定データを得ることができた。
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| Research Progress Status |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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