鳥類ニワトリからの新規生理活性ペプチドの同定と生理機能解明

• Project/Area Number: 14J05738
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Morphology/Structure
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 益田 恵子 広島大学, 総合科学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2014: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: 新規生理活性ペプチド

Outline of Annual Research Achievements

1つ目に、オーファン受容体GPR39の内因性リガンドの探索を行った。これまでに、抽出物の精製及び活性評価を繰り返すうちに、活性を見失ったり構造解析に必要な量が残らなかったりすることが多々あった。長鎖で疎水性の高いペプチドの精製時の非特異的吸着を避けることは困難であるが、活性評価において平滑筋ではなく受容体の応答を指標とすればサンプル消費量を最小限に抑えられる。そこで、グレリン受容体ファミリーに属し、2型糖尿病やうつ病への関与が示唆されているオーファン受容体であるGPR39の内因性リガンドの同定を試みた。そして、ニワトリヒナの腺胃の新規抽出法抽出物を逆相HPLCにより分画し、GPR39を発現させたHEK293細胞に添加した結果、細胞内カルシウム濃度を上昇させる画分があった。今後さらに精製を進めることにより、GPR39の内因性リガンドを同定できる可能性がある。また、他のオーファン受容体についても同様に、新規抽出法による内因性リガンドの同定が期待される。
2つ目に、新規ペプチドの網羅的探索を行った。平滑筋や受容体の応答を指標としてスクリーニングを行うと、それらに作用するものしか追跡することができない。そこで、新規抽出法抽出物に含まれるペプチドの網羅的な同定を試みた。まず、ニワトリヒナの脳の新規抽出法抽出物をゲル濾過HPLCにより分画し、さらに各画分をSDS-PAGEにより分離した。そして、数十本のバンドの中から無作為に約8kDaのバンドを切り出し、ゲル内トリプシン消化を行い、nanoLC-MS/MSにより解析した。その結果、良好なMS/MSスペクトルが得られ、データベースと照合したところユビキチンと判明した。ユビキチンは既知のタンパク質であったが、今後、同様に他のバンドの解析を進めることにより新規ペプチドを同定できる可能性がある。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Synthesis of neurosecretory protein GM composed of 88 amino acid residues by native chemical ligation (2016)
  • Author(s): Masuda K, Furumitsu M, Ooyama H, Iwakoshi-Ukena E, Ukena K
  • Journal Title: Tetrahedron Letters Volume: 57 Issue: 7 Pages: 804-807
  • DOI: 10.1016/j.tetlet.2016.01.027
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Peripheral Injection of Chicken Growth Hormone-Releasing Hormone Inhibits Feeding Behavior in Chicks (2015)
  • Author(s): Tachibana T, Kubo S, Khan MS, Masuda K, Ukena K, Wang Y
  • Journal Title: The Journal of Poultry Science Volume: 53 Issue: 1 Pages: 29-33
  • DOI: 10.2141/jpsa.0150087
  • NAID: 130005120950
  • ISSN: 1346-7395, 1349-0486
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Production and characterization of neurosecretory protein GM using Escherichia coli and Chinese Hamster Ovary cells (2015)
  • Author(s): Masuda K, Furumitsu M, Taniuchi S, Iwakoshi-Ukena E, Ukena K
  • Journal Title: FEBS Open Bio Volume: 5 Issue: 1 Pages: 844-851
  • DOI: 10.1016/j.fob.2015.10.002
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Microwave-assisted solid-phase peptide synthesis of neurosecretory protein GL composed of 80 amino acid residues. (2015)
  • Author(s): Masuda K, Ooyama H, Shikano K, Kondo K, Furumitsu M, Iwakoshi-Ukena E, Ukena K.
  • Journal Title: Jornal of Peptide Science Volume: in press Issue: 6 Pages: 454-460
  • DOI: 10.1002/psc.2756
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Effects of neurotensin and LANT-6 on food intake in chicks (2015)
  • Author(s): Masuda K, Iwakoshi-Ukena E, Tachibana T, Ukena K
  • Journal Title: American Journal of Life Sciences Volume: 3 Issue: 3 Pages: 17-23
  • DOI: 10.11648/j.ajls.s.2015030302.14
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Central administration of chicken growth hormone-releasing hormone decreases food intake in chicks. (2015)
  • Author(s): Tachibana T, Sugimoto I, Ogino M, Khan MS, Masuda K, Ukena K, Wang Y.
  • Journal Title: Physiology and Behavior Volume: 139 Pages: 195-201
  • DOI: 10.1016/j.physbeh.2014.11.043
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effects of neurotensin and LANT-6 on food intake in chicks. (2015)
  • Author(s): Masuda K, Iwakoshi-Ukena E, Tachibana T, Ukena K.
  • Journal Title: American Journal of Life Science Volume: in press
  • Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of neurotensin and LANT-6 and localization of mRNA encoding their precursor in the chicken brain. (2014)
  • Author(s): Masuda K, Iwakoshi-Ukena E, Bessho Y, Taniuchi S, Maejima S, Shikano K, Kondo K, Furumitsu M, Ukena K.
  • Journal Title: Zoolical Science Volume: 31 Issue: 6 Pages: 353-359
  • DOI: 10.2108/zs140010
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of an avian histidine decarboxylase and localization of histaminergic neurons in the chicken brain. (2014)
  • Author(s): Bessho Y, Iwakoshi-Ukena E, Tachibana T, Maejima S, Taniuchi S, Masuda K, Shikano K, Kondo K, Furumitsu M, Ukena K.
  • Journal Title: Neuroscience Letter Volume: 578 Pages: 106-110
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2014.06.048
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Syntheses of neurosecretory protein GL and neurosecretory protein GM (2015)
  • Author(s): Masuda K, Iwakoshi-Ukena E, Ukena K
  • Organizer: 第40回日本比較内分泌学会大会
  • Place of Presentation: 広島（JMSアステールプラザ）
  • Year and Date: 2015-12-11
• [Presentation] Synthesis of neurosecretory protein GL and neurosecretory protein GM using microwave-assisted solid-phase peptide synthesis combined with pseudo-proline dipeptides (2015)
  • Author(s): Masuda K, Iwakoshi-Ukena E, Ukena K
  • Organizer: 第52回ペプチド討論会
  • Place of Presentation: 神奈川(平塚中央公民館)
  • Year and Date: 2015-11-16
• [Presentation] 合成困難な新規小タンパク質NPGL及びNPGMの産出 (2015)
  • Author(s): 益田恵子、岩越栄子、浮穴和義
  • Organizer: 第6回ペプチド・ホルモン研究会
  • Place of Presentation: 石川（金沢大学臨界実験施設）
  • Year and Date: 2015-10-16
• [Presentation] ニワトリにおけるニューロテンシン及び関連ペプチドの摂食行動への影響 (2015)
  • Author(s): 益田恵子、岩越-浮穴栄子、橘哲也、浮穴和義
  • Organizer: 日本動物学会第86回大会
  • Place of Presentation: 新潟（朱鷺メッセ・新潟コンベンションセンター）
  • Year and Date: 2015-09-17
• [Presentation] 新規生理活性物質の探索－新規抽出法構築の試みと展望－ (2014)
  • Author(s): 益田恵子、浮穴和義
  • Organizer: 第5回 ペプチド・ホルモン研究会
  • Place of Presentation: 旭川医科大学
  • Year and Date: 2014-12-13