生物時計に関与する分子シャペロンとATP依存性プロテアーゼの同定とその作用機構

• Project/Area Number: 15032220
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石浦 正寛 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (20132730)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉山 康雄 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70154507)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥8,400,000 (Direct Cost: ¥8,400,000); Fiscal Year 2004: ¥4,200,000 (Direct Cost: ¥4,200,000); Fiscal Year 2003: ¥4,200,000 (Direct Cost: ¥4,200,000)
• Keywords: 藍色細菌 / 生物時計 / 時計タンパク質 / 分子装置 / KaiA / KaiC / 相互作用 / ストイキオメトリ / Walkerモチーフ / 六量体ポット構造 / ATP / 好熱性藍植細菌 / Thermosynechococcus elongatus BP-1

Research Abstract

藍色細菌の生物時計は時計タンパク質(KaiA、KaiB、KaiC)及び時計関連タンパク質(Pex、SasA)から構成される。それらタンパク質、タンパク質複合体による時計分子装置の作動機構-「時計の分子装置がどのようにして、24時間周期の振動を発振するか」-の原子レベルでの解明を目指している。時計タンパク質KaiAとKaiCとの複合体形成(相互作用)はリズム発振に重要であり(Uzumaki et al.,2005,Nature Struct.Mol.Biol.)、その相互作用の解明が不可欠である。その一環としてストイキオメトリを決定した。藍色細菌生物時計分野初となるin vitro生化学解析である。in vitroで、AMPPNP(加水分解されないATPアナログ)存在下ではKaiC-KaiA複合体の検出に成功し、複数の手法でKaiA二量体:KaiC六量体=2:1であることを明らかにした。さらに、生体分子相互作用測定装置を用いてATP存在下ではKaiA二量体:KaiC六量体=1:1であることを明らかにした。KaiCリン酸化促進に対するKaiAのdose responseを調べたところ、1/2 max=0.25分子だった。以上より、一分子の六量体型KaiCに二分子のKaiA二量体が結合可能であり、KaiA一分子の相互作用でKaiCリン酸化を充分に促進すると結論した(Hayashi et al.,2004,BBRC)。今後は、KaiAによるKaiCリン酸化促進メカニズムを原子レベルで解明するため、KaiA-KaiC複合体の構造決定を目指す。また、昨年度のKaiAの原子構造解明に続き、KaiBの構造決定に成功した。サブユニット構造は新規フィールドであり、Native構造は極めてユニークな菱形板状構造であった。四量体であることは化学架橋法と分析超遠心法で確認した。静電ポテンシャル解析より、特徴的なサブ構造(1)Negative ridgeと(2)Positive cleftとを見いだした。それぞれのサブ構造にアミノ酸置換変異を導入した藍色細菌変異体を作成しin vitro生化学解析とin vivoリズム解析を行い、両サブ構造が概日リズム発振に重要であることを明らかにした(Iwase et al., submitted)。

Research Products

• [Journal Article] Global Analysis of Circadian Expression in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. (2005)
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tsuchiya, Y., Nomura, S., Nango, M., Kanehisa, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 187 Pages: 2190-2199
• [Journal Article] 生物時計装置を原子レベルで解明する (2005)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 林史夫, 石浦正寛
  • Journal Title: 蛋白質・核酸・酵素 50 Pages: 111-120
• [Journal Article] Crystal structure of the C-terminal clock-oscillator domain of the cyanobacterial KaiA protein. (2004)
  • Author(s): Uzumaki, T., Fujita, M., Nakatsu, T., Hayashi, F., Shibata, H., Itoh, N., Kato, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Nature Struct.Mol.Biol. 11 Pages: 623-631
• [Journal Article] Circadian rhythms in the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococus elongatus : compensation of period length over a wide temperature range. (2004)
  • Author(s): Onai, K., Morishita, M., Itoh, S., Okamoto, K., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 186 Pages: 4972-4977
• [Journal Article] Large-scale screening of Arabidopsis circadian clock mutants by a high-throughput real-time bioluminescence monitoring system. (2004)
  • Author(s): Onai, K., Okamoto, K., Nishimoto, H., Morioka, C., Hirano, M., Kami-ike, N., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant J. 40 Pages: 1-11
• [Journal Article] Determinants of sensitivity and specificity in spotted DNA microarrays with unmodified oligonucleotides. (2004)
  • Author(s): Kucho, K., Yoneda, H., Harada, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. 79 Pages: 189-197
  • NAID: 10014154547
• [Journal Article] Roles of two ATPase-motif-containing domains in cyanobacterial circadian clock protein KaiC. (2004)
  • Author(s): Hayashi, F., Ito, N., Uzumaki, T., Iwase, R., Tsuchiya, Y., Yamakawa, H., Morishita, M., Onai, K., Itoh, S., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 279 Pages: 52331-52337
• [Journal Article] Construction of unmodified oligonucleotide-based microarray in the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1. (2004)
  • Author(s): Kucho, K., Tsuchiya, Y., Okumoto, Y., Harada, M., Yamada, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. 79 Pages: 319-329
• [Journal Article] 分子装置としての生物時計 (2004)
  • Author(s): 石浦正寛
  • Journal Title: 名大トピックス 139 Pages: 34-35
• [Journal Article] 藍色細菌の時計タンパク質KaiAの構造と機能 機能ドメイン、X線結晶構造解析及び構造-機能相関の解明 (2004)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 中津亨, 加藤博章, 石浦正寛
  • Journal Title: SPring-8 Information 9 Pages: 367-371
• [Journal Article] 藍色細菌の時計タンパク質KaiAの原子構造と時計機能 (2004)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 石浦正寛
  • Journal Title: ブレインテクノニュース 105 Pages: 25-29
• [Journal Article] RAP, an integrated program for monitoring bioluminescence and analyzing circadian rhythms in real time.
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ishiura, M
  • Journal Title: Anal Biochem. (印刷中)
• [Journal Article] Identification of novel clock-regulated genes by cDNA macroarray analysis in Chlamydomonas reinhardtii
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tabata, S., Fukuzawa, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant Mol.Biol. (印刷中)
• [Journal Article] Improvement of the bioluminescent reporter system for real-time monitoring of circadian rhythms in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803
  • Author(s): Kucho, K., Aoki, K., Itoh, S., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. (印刷中)
  • NAID: 10015512154
• [Journal Article] An automated apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ezaki, N., Ofuchi, T., Ishiura, M.
  • Journal Title: Anal Biochem. (印刷中)
• [Patent(Industrial Property Rights)] 葉緑体で機能するホタルルシフェラーゼ遺伝子とそれを用いた葉緑体遺伝子発現のリアルタイムモニタリング (2005)
  • Inventor(s): 石浦 正寛, 松尾 拓也, 小内 清
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Number: 2005-029217
  • Filing Date: 2005-02-04
• [Patent(Industrial Property Rights)] 制御プログラム及び培養装置 (2004)
  • Inventor(s): 石浦 正寛, 岡本 和久
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Number: 2004-380651
  • Filing Date: 2004-12-28
• [Publications] Onai K.et al.: "Natural transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1 : a simple and efficient method for gene transfer"Mol.Genet.Genomics. 271. 50-59 (2004)
• [Publications] Hayashi F.et al.: "Stoichiometric interactions between cyanobacterial clock proteins KaiA and KaiC and enhancement of KaiC phosphorylation"Biochem.Biophy.Res.Comm.. 361. 195-202 (2004)
• [Publications] Iwase R.et al.: "Crystalization and preliminary crystallographic analysis of the circadian clock protein KaiB from the thermophillic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1"Acta.Crystallogr.D. (印刷中). (2004)
• [Publications] Burder R.et al.: "Identification of a new cryptochrome class : structure, function and evolution"Mol.Cell. 11. 59-67 (2003)
• [Publications] Hayashi F.et al.: "ATP-induced hexameric ring structure of the cyanobacterial circadian clock protein KaiC"Genes to Cells. 8. 287-296 (2004)