HNK-1糖鎖合成遺伝子を分子プローブとした神経系特異的糖鎖の機能解析

Research Project

Project/Area Number	15390025
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Research Field	Biological pharmacy
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	岡昌吾京大, 薬学研究科(研究院), 助教授 (60233300)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	川嵜敏祐京都大学, 薬学研究科, 教授 (50025706)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥13,100,000 (Direct Cost: ¥13,100,000) Fiscal Year 2004: ¥4,800,000 (Direct Cost: ¥4,800,000) Fiscal Year 2003: ¥8,300,000 (Direct Cost: ¥8,300,000)
Keywords	HNK-1糖鎖 / グルクロン酸転移酵素 / 細胞接着分子 / 遺伝子欠損マウス / 基質特異性 / 結晶構造解析
Research Abstract	単クローン抗体HNK-1により認識されるHNK-1糖鎖は、神経系に存在するNCAM, L1, P0などの細胞接着分子に特徴的に発現し、神経の初期発生段階、神経回路の形成段階および神経回路の維持など様々な過程において重要な働きを持つことが示されてきており注目されている。本研究において、現在までに得られているこれらHNK-1糖鎖合成に関与する遺伝子や遺伝子改変動物を用いて以下のことを明らかにした。 1)HNK-1糖鎖合成酵素遺伝子を用いたHNK-1糖鎖の発現調節機構の解明 HNK-1糖鎖発現の律速酵素であるGlcAT-PとGlcAT-Sの基質認識機構を生化学的、構造生物学的に明らかにするために、大腸菌を用いてGlcAT-PおよびGlcAT-Sの膜貫通領域を欠失させた可溶型酵素タンパク質の大量発現系を確立し、その基質特異性を様々な糖鎖に対する糖転移活性を測定したところGlcAT-Pは糖鎖末端に存在する2糖を厳密に認識するのに対し、GlcAT-Sはより大きな糖鎖構造を認識することが明らかとなった。またGlcAT-Pに関しては、結晶が得られ、そのX線結晶構造解析が進んでいる(高エネルギー加速研究所との共同研究)。 2)HNK-1糖鎖合成酵素遺伝子欠損マウスの作製とその解析既に得られているGlcAT-P遺伝子欠損マウスにおいて、一部HNK-1糖鎖発現が残存していた。この残存するHNK-1糖鎖の機能を明らかにするため、もう一つのHNK-1糖鎖合成遺伝子であるGlcA-Sの遺伝子欠損マウスの作製を行った。ターゲッティングベクターをES細胞に導入後、相同組み替えES細胞をマウス杯盤胞に導入し、キメラマウスの作成に成功した。さらにキメラマウスとC57BL6マウスとの交配によりヘテロ変異マウスが得られた。現在ヘテロ変異マウス同士の交配によりホモ変異マウスを得、その表現型を解析している。