マウス前脳虚血モデルの樹立とRNA干渉を用いた遺伝子導入マウスの作製および解析

• Project/Area Number: 15650067
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Nerve anatomy/Neuropathology
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 芝崎 太 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (90300954)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 裕之 財団法人東京都医学研究機構, 研究員 (30301732) ; 内野 博之 東京医科大学, 八王子医療センター・麻酔科, 講師 (60266476)
• Project Period (FY): 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2004: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2003: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 免疫抑制剤 / 虚血 / カルシニューリン / 遺伝子改変動物 / RNA干渉 / カルシウム / 前脳虚血モデル

Research Abstract

(1)マウス前脳虚血モデルの樹立
これまで、マウスの前脳虚血モデルを樹立するため様々な検討を行ってきた。本研究では、温度管理のため手術野および手術用顕微鏡をアクリルボードで覆い、全体を37℃に保てるシステムを構築した。さらにはマウス個体間や手術手技自体の誤差をなくすため、赤外線脳血流計を用いて虚血効果を定量化した。これによりさらに虚血の正確性が増した。
(2)カルシニューリン活性により制御されるNCX受容体の機能解析
海馬のスライスを用いたin vitroの実験系において、CsAおよびFK506の投与により、低酸素刺激による細胞内カルシウム上昇がきわめて効果的に抑制できることが判明した(東京薬科大学、工藤佳久教授との共同研究)。これらの薬剤の共通のターゲットであるカルシニューリンが、カルシウム受容体(細胞膜、または細胞内)を制御していることを示している。現在、遅発性に起こる細胞内カルシウム上昇がNa/Ca exchange transporter(NCX)受容体、特にNCX2受容体がカルシニューリンにより制御されていることが判明しているが。本研究では、虚血による細胞内カルシウムの上昇にこのNCX2受容体が重要な役割を果たしていることが予想されたため、まず、NCXの各サブタイプの抗体を用いて虚血ラット海馬におけるNCXを調べた。NCX1および2は虚血後12-24時間で海馬神経細胞に発現の上昇がみられた。次に、カルシニューリンを含むこれらの遺伝子に対してsiRNAを作製した。まず、カルシニューリンに対するsiRNAは6種類のうち2種類がサブタイプ別に効率よくカルシニューリンを抑制した。さらにNCXに関しては現在作製中である。今後はこれらのsiRNAを用いて培養細胞や遺伝子改変動物(ノックダウンマウス)を作製しさらに解析を進める予定である。

Research Products

• [Journal Article] Potent neuroprotection of CsA by inhibiting pathways involving calcinenum and cyclophilin D in forebrain ischemia. (2005)
  • Author(s): Shibasaki, F, Uchino, H., Kristian, T., Perkins, G., Ishii, N., Siesio, B.K.
  • Journal Title: Pharmacology of Cerebral Ischemia(Medpharm Scientific Publisher Stuttgart) Pages: 453-465
• [Journal Article] Bcl-2 phosphorylation precedes caspases-3 activation and cell death after neonatal cerebral hypoxia-ischemic injury (2005)
  • Author(s): Hallin, U., Kondo, E., Shibasaki, F., Blomgren, K.
  • Journal Title: Neuroscience (in press)
• [Journal Article] Calcium Signal-induced Coffilin Dephosphorylation is Mediated by Slingshot via Calcineurin. (2005)
  • Author(s): Wang, Y., Shibasaki, F., Niwa, R., Uemura, T., Mizuno, K.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. (in press)
• [Journal Article] Gα12/13-mediated production of reactive oxygen speicies is critical for angiotensin II receptor-induced NFAT activation in cardiac fibroblasts. (2005)
  • Author(s): Fujii, T., Onohara, N., Fukutomi, M., Nagamatsu, Y., Naruyama, Y., Kobayashi, H., Inoue, R., Sugimoto, H., Shibasaki, F., Nagao, T., Nishida, M., Kurose, H
  • Journal Title: J.Biol.Chem. (in press)
• [Journal Article] T細胞アレルギーによる免疫制御 (2005)
  • Author(s): 芝崎 太
  • Journal Title: 日本臨床 (In press)
• [Journal Article] 脳蘇生における薬物療法 (2005)
  • Author(s): 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • Journal Title: 蘇生 (In press)
  • NAID: 10013501306
• [Journal Article] Calcineurin inhibits Na^+/Ca^<2+> exchange in phenylephrine-treated hypertrophic cardiomyocytes. (2004)
  • Author(s): Yuki Katanosaka, Yuko Iwata, Yuko Kobayashi, Futoshi Shibasaki, Shigeo Wakabayashi, Munekazu Shigekawa
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 5764-5772
• [Journal Article] Histon deacetylase 7 associates with hypoxia- inducible factor 1 alpha and regulate transcriptional activity. (2004)
  • Author(s): Kato H, Tamamizu-Kato S, Shibasaki F
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 274 Pages: 41966-41974
• [Journal Article] Activation of the CKI-CDK-Rb-E2F pathway in full genome hepatitis C virus-expressing cells. (2004)
  • Author(s): Tsukiyama-Kohara K, Tone S, Maruyama I, Inoue K, Katsume A, Nuriya H, Ohmori H, Ohkawa J, Taira K, Hoshikawa Y, Shibasaki F. et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 279 Pages: 14531-14541
• [Journal Article] Calcineurin and cyclophilin D are differential targets of neuroprotection by immunosuppressants CsA and FK506 in ischemic brain damage. (2004)
  • Author(s): Uchino H, Ishii N, Shibasaki F
  • Journal Title: Acta Neurochir Suppl. 86 Pages: 105-111
• [Journal Article] 日本のTRCの現状と展望 (2004)
  • Author(s): 芝崎 太
  • Journal Title: Medichem News 14 Pages: 7-11
• [Journal Article] eTagによる癌治療効果予測 (2004)
  • Author(s): Sharat Singh, 戸井雅和, 芝崎 太
  • Journal Title: 細胞 36 Pages: 31-35
• [Journal Article] 新規同時他項目アッセイシステムeTagの応用 (2004)
  • Author(s): 芝崎 太
  • Journal Title: バイオベンチャー 18 Pages: 38-40
• [Journal Article] 虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性 (2004)
  • Author(s): 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • Journal Title: Life support and Anesthesia 11 Pages: 1-18
• [Journal Article] 虚血による神経細胞死とカルシニューリン、シクロフィリン (2004)
  • Author(s): 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • Journal Title: Biotherapy 18 Pages: 115-127
• [Journal Article] ミトコンドリア膜透過性に対するシクロスポリンの作用 (2004)
  • Author(s): 芝崎 太, 内野博之
  • Journal Title: 医薬ジャーナル 40 Pages: 172-177
• [Journal Article] ミトコンドリア膜透過性に対するシクロスポリンの作用。特集:シクロスポリンの作用〜解明された多様性〜 (2004)
  • Author(s): 芝崎 太, 内野博之
  • Journal Title: 医薬ジャーナル特集号 Pages: 30-35
• [Journal Article] 特集「病態とアポトーシス」虚血による神経細胞死とカルシウム・カルシニューリン (2004)
  • Author(s): 芝崎 太, 内野博之
  • Journal Title: Biotherapy 18 Pages: 23-26
• [Journal Article] 「脳を守るための戦略」虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性 (2004)
  • Author(s): 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫
  • Journal Title: Lisa 11 Pages: 114-117
• [Publications] Tomida T, Hirose K, Takizawa A, Shibasaki F, Iino M: "NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2^+ oscillation"EMBO J.. 22. 3825-3832 (2003)
• [Publications] 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫: "「脳を守るための戦略」虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性について"Lisa. 11. 114-117 (2004)
• [Publications] 芝崎 太, 内田和代: "新規同時他項目アッセイシステムeTagの応用"バイオベンチャー. 18. 38-40 (2004)
• [Publications] 芝崎 太, 内野博之: "特集「病態とアポトーシス」虚血による神経細胞死とカルシウム・カルシニューリン"Biotherapy. 18. 23-26 (2004)
• [Publications] 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫: "虚血性神経細胞死におけるカルシニューリンの役割"臨床検査(医学書院). 12-18 (2003)