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ln-Cell NMR:細胞内蛋白質間相互作用の直接解析法の開発

Research Project

Project/Area Number 15657031
Research Category

Grant-in-Aid for Exploratory Research

Allocation TypeSingle-year Grants
Research Field Functional biochemistry
Research InstitutionTokyo Metropolitan University (2005)
The Institute of Physical and Chemical Research (2003-2004)

Principal Investigator

伊藤 隆  首都大学東京, 都市教養学部理工学系, 教授 (80261147)

Project Period (FY) 2003 – 2005
Project Status Completed (Fiscal Year 2005)
Budget Amount *help
¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2005: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
KeywordsIn-Cell NMR / 生細胞 / 蛋白質間相互作用 / 安定同位体標識 / 高分解能 / 非破壊性 / 非線形サンプリング / 異種核多次元NMR
Research Abstract

本研究の目的は,In-Cell NMRの手法を用いて,生細胞中の蛋白質間相互作用を直接観測するシステムを確立するというものである.
平成17年度は平成16年度までの結果を基にして以下のポイントについて開発研究を行った.
1.^<13>C/^<15>N二重標識を用いたIn-Cell NMRシグナルの帰属法の検討
細胞内蛋白質の動態を解析するためには,In-Cell NMRを用いてシグナルの位置特異的帰属を行っていく必要がある.一方で平成16年度までの研究から,In-Cell NMR測定では,(1)細胞中の目的蛋白質の寿命が短い,(2)細胞中の蛋白質濃度が低いため感度が低い,(3)細胞中の粘性などの影響でシグナルの線幅が著しく増大する,などの問題点が明らかになっていた.平成17年度は,これらの問題を解決するために,異種核多次元NMRを短時間で感度よく測定する手法の確立を行った.具体的には,非線形サンプリング法で測定したデータを最大エントロピー法を用いて処理を行なうことで,数時間で十分な感度と分解能を持つ3次元In-Cell NMRスペクトルを得ることに成功した.この手法を用いることで,生きた大腸菌中のCalmodulin(14kDa),およびCalmodulinのN末端およびC末端ドメインについて,主鎖NMRシグナルの帰属を行なうことができた.またこの手法は,In-Cell NMRのみならず,これまで解析の困難であった,溶解度が低く不安定な蛋白質の解析にも極めて有用であることを示した.
2.In-Cell NMRを用いた蛋白質間相互作用の解析の試み
In-Cell NMR法を発展させることで,細胞内の蛋白質間互作用を従来法より高分解能で観測できる手法となる可能性がある.CalmodulinおよびCalmodulinと相互作用する蛋白質の大腸菌内共発現系を構築し,細胞内での蛋白質間相互作用の解析を行なった.

Report

(3 results)
  • 2005 Annual Research Report
  • 2004 Annual Research Report
  • 2003 Annual Research Report
  • Research Products

    (9 results)

All 2006 2005 2004 Other

All Journal Article (5 results) Book (1 results) Publications (3 results)

  • [Journal Article] Heteronuclear multidimensional NMR and homology modelling studies of the C-terminal nucleotide-binding domain of the human mitochondrial ABC transporter ABCB62006

    • Author(s)
      Kaori Kurashima-Ito
    • Journal Title

      Journal of Biomolecular NMR (印刷中)

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Design of λ Cro fold : solution structure of a monomeric variant of the denovo protein2005

    • Author(s)
      Yasuhiro Isogai
    • Journal Title

      Journal of Molecular Biology 354

      Pages: 801-814

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Solution structure of the C-terminal transcriptional activator domain of FixJ from Sinorhizobium meliloti and its recognition of the fixK promoter2005

    • Author(s)
      Kaori Kurashima-Ito
    • Journal Title

      Biochemistry 44

      Pages: 14835-14844

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Backbone ^1H, ^<13>C, and ^<15>N assignments of a 56 kDa E. coli nickel binding protein NikA2005

    • Author(s)
      Sundaresan Rajesh
    • Journal Title

      Journal of Biomolecular NMR 32

      Pages: 177-177

    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Journal Article] Myristoylation-regulated direct interaction between calcium-bound calmodulin and N-terminal region of pp60^<v-src>2004

    • Author(s)
      Nobuhiro Hayashi
    • Journal Title

      Journal of Molecular Biology 338

      Pages: 169-180

    • Related Report
      2004 Annual Research Report
  • [Book] 生命秩序を担う生体超分子 蛋白質・核酸・酵素 2005年8月号増刊2005

    • Author(s)
      伊藤 隆(共著)
    • Total Pages
      1404
    • Publisher
      共立出版
    • Related Report
      2005 Annual Research Report
  • [Publications] Masatoshi Yoshimasu: "An NMR study on the interaction of Escherichia coli DinI with RecA-ssDNA complexes."Nucleic Acids Research. 31. 1735-1743 (2003)

    • Related Report
      2003 Annual Research Report
  • [Publications] Sundaresan Rajesh: "A novel method for the biosynthesis of deuterated proteins with selective protonation at the aromatic rings of Phe, Tyr and Trp."Journal of Biomolecular NMR. 27. 81-86 (2003)

    • Related Report
      2003 Annual Research Report
  • [Publications] Masayoshi Honda: "Backbone ^1H, ^<13>C, and ^<15>N Assignments of a 42 kDa RecR Homodimer."Journal of Biomolecular NMR. 28. 199-200 (2004)

    • Related Report
      2003 Annual Research Report

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Published: 2003-04-01   Modified: 2016-04-21  

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