マウス遺伝子改変の高効率化:ターゲティングベクターの正確かつ迅速な構築法

• Project/Area Number: 15657041
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Molecular biology
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 和田 洋 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (50212329)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2004: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2003: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: 遺伝子改変動物 / 形質転換 / オルガネラ / ノックアウトマウス / 相同組換え / ES細胞 / トランスジェニックマウス / ターゲティングベクター / 大腸菌人工染色体

Research Abstract

遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.

Research Products

• [Journal Article] Simple and straightforward construction of a mouse gene targeting vector using in vitro transposition reaction (2005)
  • Author(s): M.Aoyama et al.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. (印刷中)
• [Journal Article] Diverse and essential roles pf mammalian vacuolar-type proton ATPase : toward the physiological understanding of inside acidic compartments (2004)
  • Author(s): G.-H.Sunwada et al.
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta 1658 Pages: 106-114
• [Journal Article] Regulatory elements directing gut expression of the GATA6 gene during mouse early development (2004)
  • Author(s): G.-H.Sunwada et al.
  • Journal Title: J Biochem 135 Pages: 165-169
• [Journal Article] Proton pumping ATPases and diverse inside-acidic compartments. (2004)
  • Author(s): Futai M et al.
  • Journal Title: Yakugaku Zasshi 1245 Pages: 243-250
• [Journal Article] Proton translocating ATPases : introducting unique enzymes coupling catalysis and proton translocation through mechanical rotation (2004)
  • Author(s): Futai M.et al.
  • Journal Title: Handbook of ATPases : Biochemistry, Cell Biology.Pathophysiology Pages: 237-256
• [Journal Article] Vacuolar-type proton ATPases : subunit isoforms and tissue-specific function (2004)
  • Author(s): G.-H.Sun-wada et al.
  • Journal Title: Handbook of ATPases : Biochemistry, Cell Biology, Pathophysiology Pages: 379-392
• [Publications] Sun-Wada, G.H.et al.: "Mouse proton pump ATPase C subunit isoforms (C2-a and C2-b) specifically expressed in kidney and lung"J.Biol.Chem.. 278. 44843-44851 (2003)
• [Publications] Suzuki, J.et al.: "Involvement of syntaxin 7 in human gastric epithelial cell vacuolation induced by the Helicobacter pylori-produced cytotoxin VacA."J.Biol.Chem.. 278. 25585-25590 (2003)
• [Publications] Toyomura, T.et al.: "From lysosomes to plasma membrane : Localization of vacuolar type H^+-ATPase with the a3 isoform during osteoclast differentiation."J.Biol.Chem.. 278. 22023-22030 (2003)
• [Publications] Sun-Wada, G.H.et al.: "Diversity of mouse proton-translocating ATPase : presence of multiple isoforms of the C, d and G subunits."Gene. 302. 147-153 (2003)
• [Publications] Hirata, T.et al.: "Subunit rotation of vacuolar-type proton pumping ATPase : Relative rotation of the G as to c subunit"J.Biol.Chem.. 278. 23714-23719 (2003)
• [Publications] Sun-Wada, G.-H.et al.: "Lysosome and lysosome-related organelles responsible for specialized functions in higher organisms, with special emphasis on vacuolar-type proton ATPase."Cell Struct.Funct. 28. 455-463 (2003)