all-D型タンパク質の新規機能性の探索と合成系確立の試み

• Project/Area Number: 15658030
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 小川 智久 東北大学, 生命科学研究科, 助教授 (80240901)
• Project Period (FY): 2003 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2005: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2004: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2003: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: レクチン / フラグメント縮合法 / キラル認識能 / タンパク質発現 / ペプチド合成 / キラル認識 / ガレクチン / 糖鎖 / 分子キラリティー / D型アミノ酸

Research Abstract

本研究では、糖鎖を厳密に認識するレクチン分子をモデルとして、そのキラル認識能についてD型タンパク質の合成およびキラル糖鎖との相互作用解析、複合体のX線構造解析により詳細な相互作用様式を明らかにすることを目的とした。そのため先ず魚類マアナゴ体表粘液に存在する2種のガレクチン(コンジェリンIおよびII)のうちコンジェリンIIについて、グリシンを除く全アミノ酸をD型とするタンパク質の化学合成を行い、Ac-Ser1-Gly35(C4 fragment), Glu36-Gly68(C3 fragment), Trp69-Gly104(C2 fragment), Glu105-Glu135(C1 fragment)の4つのセグメントに分割して合成を行った。すべてのフラグメントについての合成を終え、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製した。チオエステル法よるフラグメント縮合法によりC1 fragmentとC2 fragmentの宿業をおこなった。フラグメントの不溶化により、効率的なカップリングおよび反応後の精製が困難であった。TofMSにより反応を確認したが、最終的なall-D型レクチン分子を大量に調製し、機能、特性を解析するまでには至らなかった。
本実験の副次的な研究成果として、コンジェリンIIをタグとした発現系構築へと発展させたところ、コンジェリンII自体がシャペロンとして働くこと、さらにシャペロンとの共発現系を構築したところ、これまで発現が非常に困難であった蛋白質(7組のジスルフィド結合を含む)およびその各種変異体を可溶化物として、また正しいフォールドで大量に発現させることに成功した。

Research Products

• [Journal Article] Opsonic effect of congerin, a mucosal galectin of the Japanese conger, Conger myriaster (Brevoort). (2006)
  • Author(s): Nakamura, O., Matsuoka, H., Ogawa, T., Muramoto, K., Kamiya, H., Watanabe, T.
  • Journal Title: Fish Shellfish Immunol. 20(3) Pages: 433-435
• [Journal Article] Effect of lectins on the transport of food factors in caco-2 cell monolayers. (2006)
  • Author(s): Ohno, Y., Naganuma, T., Ogawa, T., Muramoto, K.
  • Journal Title: J Agric Food Chem. 54(2) Pages: 548-553
• [Journal Article] 加速進化によるタンパク質の耐熱化:進化工学による耐熱化機構の解明から (2006)
  • Author(s): 小川智久, 今野歩, 村本光二, 白井剛
  • Journal Title: 生物物理 (掲載受理決定)
  • NAID: 110004751709
• [Journal Article] In vitro evolutionary thermostabilization of congerin II : a limited reproduction of natural protein evolution by artificial selection pressure (2005)
  • Author(s): Shionyu-Mitsuyama C, Ito Y, Konno A, Miwa Y, Ogawa T, Muramoto K, Shirai T.
  • Journal Title: J Mol Biol 347(2) Pages: 385-397
• [Journal Article] Structure and possible function of N-glycans of an invertebrate C-type lectin from the acorn barnacle Megabalanus rosa. (2005)
  • Author(s): Matsubara, H, Kabuto S, Nakahara, N, Ogawa, T, Muramoto K, Jimbo, M, Kamiya, H
  • Journal Title: Fish.Sci., 71 Pages: 931-940
  • NAID: 10015421156
• [Journal Article] An S-like ribonuclease gene is used to generate a trap-leaf enzyme in the carnivorous plant Drosera adelae. (2005)
  • Author(s): Okabe, T, Yoshimoto I, Hitoshi, M, Ogawa, T, Ohyama, T.
  • Journal Title: FEBS Lett., 579(25) Pages: 5729-5733
• [Journal Article] Molecular diversity and accelerated evolution of C-type lectin-like proteins from snake venom. (2005)
  • Author(s): Ogawa, T., Chijiwa, T., Oda-Ueda, N., Ohno, M.
  • Journal Title: Toxicon 45 Pages: 1-14
• [Journal Article] In Vitro Evolutionary Thermostabilization of Congerin II : A Limited Reproduction of Natural Protein Evolution by Artificial Selection Pressure. (2005)
  • Author(s): Shionyu-Mitsuyama C et al.
  • Journal Title: J Mol Biol. 347(2) Pages: 385-397
• [Journal Article] Acid Hydrolysis of Protein in a Microcapillary Tube for the Recovery of Tryptophane. (2005)
  • Author(s): Adebiyi, A.P., Jin, D.-H., Ogawa, T., Muramoto, K.
  • Journal Title: Biosci.Biotech.Biochem. 69(1) Pages: 255-257
  • NAID: 130000030587
• [Journal Article] Complementary DNA Cloning and Molecular Evolution of Opine Dehydrogenases in Some Marine Invertebrates (2005)
  • Author(s): Kimura, T., Nakano, T., Yamaguchi, T., Sato, M., Ogawa, T., Muramoto
  • Journal Title: Marine Biotechnology 36(1)
  • NAID: 10014367484
• [Journal Article] The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution. (2004)
  • Author(s): Ogawa, T., et al.
  • Journal Title: Glycoconj.J. 19 Pages: 451-458
• [Journal Article] Refinement of Crystallization Condisions for the Crystal Growth Experiment of Animal Lectin (Congerin) in Space and the Evaluation of Grown Crystals (2004)
  • Author(s): Yamane, T., et al.
  • Journal Title: J.Jpn.Soc.Microgravity Appl. 21 Pages: 52-62
• [Book] 海洋生物成分の利用-マリンバイオのフロンティア-分担執筆(第6章2動物レクチン) (2005)
  • Author(s): 村本光二, 小川智久, 神谷久男
  • Total Pages: 14
  • Publisher: (株)シーエムシー出版
• [Publications] 白井剛, 塩生-光山クララ, 小川智久: "加速進化による蛋白質機能・構造の変化 魚類ガレクチンを例にして"蛋白質核酸酵素. 48. 1913-1919 (2003)
• [Publications] Chijiwa, T., Hamai, S., Tsumouchi, S., Ogawa, T., Deshimaru et al.: "Interisland mutation of a novel phospholipase A_2 from Trimeresurus flavovirisdis venom and evolution of crotalinae group II phospholipase A_2"Journal of Molecular Evolution. 57. 546-554 (2003)
• [Publications] Chijiwa, T., Yamaguchi, Y., Ogawa, T., Deshimaru et al.: "Interisland evolution of Trimeresurus flavovirisdis venom phospholipase A_2 isozym"Journal of Molecular Evolution. 56. 286-293 (2003)
• [Publications] Ogawa, T., Yonemaru, S., Naganuma, T., Hirabayashi, J., Kasai, K., Muramoto, K.: "Strong Induction of Apoptosis of T Cell Lines by Conger Eel Galactins"Biomolecular Chemistry -A Bridge for the Future-. 134-137 (2003)
• [Publications] Ogawa, T., Shirai, T., Shionyu-Mitsuyama, C., Yamane, T., Kamiya, H., Muramoto, K.: "The speciation of conger eel galectins by rapid adaptive evolution"Glycoconjugate Journal. 19. 451-458 (2004)
• [Publications] Yoshimi, K., Shoji, M., Ogawa, T., Yamauchi, A., Naganuma, T., Muramoto, K., Hanada, S.: "Microstructure and Orientation Distribution of Aragonite Crystals in Nacreous Layer of Pearl Shells"Material Trans.. In press.
• [Publications] Ohno, M., Ogawa, T., Oda-Ueda, N., Chijiwa, T., Hattori, S.: ""Accelerated evolution of snake venom gland isozyme", In Perspectives in Molecular Toxinology"Jhon Wiley & Sons, Ed by A. Menez. 14 (2003)