FRETによるプロテオリシスのin situ可視化の試み

• Project/Area Number: 15659047
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General anatomy (including Histology/Embryology)
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 三井 真一 高知大学, 医学部, 助教授 (20295661)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 由利 和也 高知大学, 医学部, 教授 (10220534) ; 大迫 洋治 高知大学, 医学部, 助手 (40335922) ; 山口 希 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (40079752)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000); Fiscal Year 2004: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: セリンプロテアーゼ / tissue plasminogen activator / plasminogen / FRET / プロテオリシス

Research Abstract

組織型プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)をモデルにFRETによるプロテアーゼ活性の検出を試みた。tPAの基質であるマウス・プレプロプラスミノーゲンは812アミノ酸からなるが、581番目のアルギニンのC末側でtPAによる切断・活性化を受ける。この近辺の21アミノ酸をリンカーにしてEYFPとECFPを連結したFRETコンストラクトを作製して、プロテアーゼ活性の可視化を試みた。
tPAの基質として作製したEYFP-PLG-ECFPをHEK293細胞に導入して、G418に対する耐性を指標に発現株の取得を行ったが、継代を重ねるにつれて発現細胞の減少が認められた。そこで、このEYFP-PLG-ECFPのN末端にHis-tagを導入して大腸菌にて発現させた。封入体を尿素を含む緩衝液で溶解した後、キレートカラムを用いてEYFP-PLG-ECFPを精製した。精製したEYFP-PLG-ECFPはFRETを示し、430nmの励起光に対して530nmの蛍光を発した。
しかしながら、これにtPAを作用させると生理的な切断サイトのみならず、EYFPやECFPに対しても分解活性を示すようで蛍光の発生が消失したことから、GFP変異体のプロテアーゼ感受性を低減させる必要が示唆された。