圧負荷心筋肥大における核骨格による情報伝達、及び遺伝子発現制御の研究

• Project/Area Number: 15659189
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Circulatory organs internal medicine
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 土屋 博 金沢医科大学, 医学部, 講師 (40188579)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩井 邦充 金沢医科大学, 医学部, 助教授 (40243274) ; 松本 正幸 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50028677)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2003: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: 心筋細胞 / 肥大 / プロモーター / 核骨格 / 転写制御 / クロスリンク / 圧負荷心筋肥大 / 細胞内情報伝達 / 遺伝子発現制御 / サウスウエスタン法 / 2次元電気泳動

Research Abstract

[目的]心筋細胞の伸展刺激による肥大過程では、転写因子とco-activatorの複合体が心筋特異遺伝子プロモーターに結合し転写活性を促進する。一方、DNAと蛋白複合体は核骨格の足場に支えられている。従って、伸展刺激が直接骨格構造の歪みを引き起こして複合体とDNAの立体構造を変形させる可能性があると考えた。この核骨格の働きを解明する第一歩として、本研究では伸展刺激によってプロモーターに近接する核骨格蛋白を同定しようとした。
[方法と結果1]ラット上行大動脈狭窄30分後においてBNPプロモーターに結合する核骨格蛋白の同定(サウスウエスタン法):心筋核骨格分画を精製、SDS-PAGE、ニトロセルロースフィルター転写、^<32>PラベルBNPプロモーターと反応させた。120kDの蛋白に結合したが、結合程度は対照心筋と差が認められなかった。
[方法と結果2]培養ラット胎児心筋細胞伸展刺激によりDNAに近接する核骨格蛋白の同定(シスプラチンクロスリンク法):心筋細胞をシリコン膜上に培養、30分間周期的伸展刺激をかけた。シスプラチンを作用させ、DNAと核蛋白をクロスリンクした。5M尿素、2Mグアニジン、2MNaClにより核骨格分画をそれに結合したDNAと共に抽出した。ハイドロキシアパタイトにDNAを吸着させ、次に結合した核骨格蛋白を溶出した。SDS-PAGEでは205kDから117kDの間に伸展していない細胞では存在しない少なくとも3本のバンドを認めた。2次元電気泳動を実験し始めたときに年度末となり、結果は得られていません。
[結論と考察]伸展刺激で有意にDNAに近接する核骨格蛋白がシスプラチンクロスリンク法により求められた。なお、抽出する核骨格の蛋白量を増量するため、細胞伸展装置を大規模なものに作製しなおす必要があり、時間を要した。