| Budget Amount *help |
¥3,100,000 (Direct Cost: ¥3,100,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
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| Research Abstract |
マウス筋芽細胞であるC2C12細胞を培養し本研究に用いた.この細胞にBMP2を加えて培養するとアルカリフォスファターゼ(ALP)活性が増加するとともに,骨芽細胞に特異的なオステオカルシンの発現が誘導され,骨芽細胞へ分化しうる.ノーザンプロット法を用い細胞接着因子のmRNA発現を検討したところ,E-カドヘリンならびにα5 integrinの発現が見られた.カドヘリンの細胞内裏打ちタンパク質であるβ-cateninはLef/Tcf1と結合してDNAに結合し転写調節の機能も有している.そこで,Lef/Tcf1応答領域レポーター(pTOP-FLASH)をC2C12細胞にトランスフェクトした.GSK-3によるリン酸化部位を欠失させた活性型β-cateninもしくはWnt3aを導入すると,pTOP-FLASHの活性は増大した.他方,non-canonical WntであるWnt-5aによっては,その活性は増加しなかった.Wnt3aと同時にBMP2を添加したところ,その活性は低下した.これらの結果から,C2C12細胞においてもWntのcanonical経路が存在しBMP2はこれに抑制的に機能することがわかった.RNAiを用いたノックダウンを行うために,α5 integrin等のインテグリンやGSK3βの一部のmRNA配列相当の合成ヌクレオチドをU6プロモーターベクターに挿入したコンストラクトを作製した.このプラスミドをC2C12細胞にトランスフェクトさせノックダウンを行い,機能解析を行ったところ,ALP活性,オステオカルシンmRNA発現の減少ならびにId1遺伝子のBMP2応答領域に対する反応性が低下し,骨芽細胞への分化が抑制された,これらの結果からインテグリンからのシグナルはβ-cateninを介して骨芽細胞分化を制御していることが明らかとなった.
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