分子認識能を持つDNAを利用した一塩基多型(SNPs)の簡便検出法の開発

• Project/Area Number: 15750070
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Analytical chemistry
• Research Institution: Tokyo University of Technology
• Principal Investigator: 矢野 和義 東京工科大学, バイオニクス学部, 助教授 (40262109)
• Project Period (FY): 2003 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2005: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2004: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2003: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: three-way junction / 胆汁酸 / アプタマー / BIAcore / SPR / マイクロプレート / SNPs / HLA / ゲノム / 一塩基多型 / ApoE / ストレプトアビジン

Research Abstract

本研究では、three-way junction構造を含むDNAと胆汁酸類の一種であるコール酸が結合すること、three-way junctionの分岐点上の一塩基が別の塩基に置き換えられるとその親和性が減少・消失することを利用して、新しいSNPs検出法の開発を行ってきた。昨年度まではBIAcoreを用いたSNPs検出法を構築してきたが、BIAcoreでは多サンプル同時測定が不可能であるという欠点があった。そこで最終年度では、本検出系をマイクロプレート上に展開し蛍光強度測定を行うことにより、多サンプル同時測定の系を確立することを目的とした。
初めに、一本鎖でthree-way junction構造を形成するビオチン標識CH-16-40-18Gを、ストレプトアビジンでコーティングした96穴マイクロプレートに固定化した。これとオレゴングリーン標識されたコール酸とを反応させることによって、SNPsのタイピングが行えるか評価した。その結果、まず緩衝液中の塩濃度を増加させることにより蛍光強度が増加することを確認した。また、この条件を用いてHLA多型における一塩基変異検出を行った結果、パーフェクトマッチとミスマッチとの間に蛍光強度の差があることを確認した。さらに、実試料からのSNPs検出を想定し、二本鎖target DNAを熱変性しプローブDNAとthree-way junction構造を形成させて一塩基変異検出を試みたところ、同様にパーフェクトマッチとミスマッチとの蛍光強度の差を認めることができた。

Research Products

• [Journal Article] Application of probes having 2'-deoxyinosine for typing of single nucleotide polymorphisms(SNPs) using DNA microarray (2006)
  • Author(s): H.Kinoshita et al.
  • Journal Title: Analytica Chimica Acta 561 Pages: 25-31
• [Journal Article] SNPs(single nucleotide polymorphisms) detection based on the formation of cholic-acid binding DNA aptamer (2005)
  • Author(s): T.Kato et al.
  • Journal Title: Nucleic Acids Symposium Series No.49 Pages: 359-360
• [Journal Article] Single nucleotide polymorphism typing on DNA array with hydrophobic surface fabricated by plasma-polymerization technique (2004)
  • Author(s): H.Miyachi, et al.
  • Journal Title: Biosensors & Bioelectronics 20 Pages: 184-189
• [Publications] 矢野和義: "アプタマー 〜バイオセンシングのための核酸分子認識素子〜"Bioベンチャー(羊土社). 5,6月号. 28-31 (2003)
• [Publications] K.Yano et al.: "Preparation of a whole genome phage library using fragmented Escherichia coli genome and its characterization of protein binding properties by surface plasmon resonance"Biosensors & Bioelectronics. 18(10). 1201-1207 (2003)
• [Publications] K.Kojima et al.: "Electrochemical Protein Chip with Arrayed Immunosensors with Antibodies Immobilized in a Plasma-Polymerized Film"Analytical Chemistry. 75(5). 1116-1122 (2003)