細胞表層に存在する膜貫通型蛋白質への機能性分子導入法の開発

Research Project

Project/Area Number	15750137
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Chemistry related to living body
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	築地真也東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (40359659)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000) Fiscal Year 2004: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Keywords	プロテインスプライシング / 蛋白質半合成 / インテイン / スプライシング / 細胞表層工学 / 蛋白質工学 / 細胞工学
Research Abstract	本研究では、細胞表層の膜貫通型蛋白質の細胞外および細胞内ドメインに様々な機能性合成分子を導入するための半合成的手法の開発を目指している。そのための基本戦略として、細胞内で発現させた蛋白質フラグメントと細胞外で調整した合成蛋白質フラグメントをSsp DnaEインテインのtrans-スプライシング活性を利用して連結させるというアプローチを試みている。現在、この手法の有効性を検証することを目的として、膜貫通型蛋白質の細胞外ドメインに大腸菌発現蛋白質あるいは合成小分子を組み込むことを行っている。そのモデル実験として血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)の膜貫通ドメインをターゲットにしており、PDGFR膜貫通ドメインのN末端にDnaE(C)を融合させたキメラ蛋白質の発現ベクターを作成した。このプラスミドを動物細胞内(HEK293)で発現させ、タグの免疫蛍光染色を用いてDnaE(C)ドメインが望み通り細胞の外に提示されていることを確認した。また大腸菌発現系を利用してGST-TEVproteaseSite-DnaE(N)というコンストラクトを調整した。更にこのコンストラクトをTEVプロテアーゼによって切断後、N末端に生じるシステイン残基を狙って特異的に合成小分子(フルオレセインやビオチン等)を修飾した。現在、動物細胞上でのtrans-スプライシング反応および細胞表層への蛋白質あるいは小分子ラベリングについて評価し、細胞外ドメインの化学半合成というアプローチの可能性について検討を進めている段階である。