コンピューター内進化による疾病原因酵素阻害DNAアプタマーの探索

• Project/Area Number: 15760584
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biofunction/Bioprocess
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 池袋 一典 国立大学法人東京農工大学, 大学院・共生科学技術研究部, 助教授 (70251494)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2004: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2003: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
• Keywords: 新規進化工学的手法 / コンピューター内進化 / Porphyromonas ginigivalis / gingipain / Taq DNA polymerase / Gカルテット構造 / DNAアプタマー / 阻害剤 / サルモネラ / シアリダーゼ

Research Abstract

本研究は、申請者の開発した新規進化的手法を用いて、疾病原因酵素を阻害するDNAアプタマーを、探索することを目的としている。
まず、平成15年度に引き続き、歯周病の原因となるPorphyromonas ginigivalisのgingipainに対して、いくつかの選択条件を変えた上で、SELEXを数ラウンド行い標的酵素に結合するDNAアプタマーを探索したが、gingipainに対して強い結合能を示すアプタマーは得られなかった。アプタマーは糖-リン酸骨格を有し、多数の負電荷を持つのでgingipainに対しては、有効なリガンドとならない可能性も考えられる。
そこで、酵素阻害活性を持つアプタマーを効率よく探索する手法として、SELEXにより探索されたDNAアプタマーを、コンピューターを利用して進化させる、新しい進化工学的手法の開発を試みた。Taq DNA polymeraseを標的酵素とし、SELEXである程度標的酵素に結合するDNAアプタマーを絞り込んだ。その後、候補アプタマーのTaq DNA polymeraseの阻害活性を評価し、これに従って順位付けをした後、コンピューターを用いて、上位のアプタマーの塩基配列を混成し、次世代の酵素阻害アプタマーの塩基配列を10個作成した。これを合成し、それぞれの酵素阻害活性を測定し、再びこの活性を指標に順位を決定した。
この操作を繰り返すことにより、世代毎に阻害活性の上昇したアプタマーを得ることができ、6世代後にはIC_<50>がnMレベルの強い阻害能を示すアプタマーを得ることができた。このアプタマーは,田の研究グループがSELEXに依って得たTaq DNA polymerase阻害アプタマーとは全く異なった塩基配列と構造を有し、本方法が、酵素活性阻害アプタマーを得る新規方法として有用であることが示された。

Research Products

• [Journal Article] Electrochemical Detection of Protein Using a Double Aptamer Sandwich (2004)
  • Author(s): Kazunori Ikebukuro et al.
  • Journal Title: Analytical Letters 37・14 Pages: 2901-2909
• [Journal Article] Selection of DNA aptamers that inhibit Taq DNA polymerase by an algorithm mimicking evolution (2004)
  • Author(s): Kazunori Ikebukuro et al.
  • Journal Title: Nippon Kessho Seicho Gakkaishi 37・3 Pages: 190-190
• [Publications] Kazunori Ikebukuro et al.: "Screening of DNA aptamers inhibiting Taq DNA polymerase using algorithm mimicking evolution"Nucleic Acids Research Supplement 3(3rd International Symposium on Nucleic Acids Chemistry [and] 30th Symposium on Nucleic Acids Chemistry in Japan,2003. Supplement 3. 309-310 (2003)
• [Publications] Kazunori Ikebukuro et al.: "Novel strategy for DNA aptamers inhibiting enzymatic using algorithm mimicking evolution"Nucleic Acids Research Supplement 3(3rd International Symposium on Nucleic Acids Chemistry [and] 30th Symposium on Nucleic Acids Chemistry in Japan,2003. Supplement 3. 205-206 (2003)