| Project/Area Number |
15770077
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
千田 俊哉 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物情報解析研究センター, 主任研究員 (30272868)
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| Project Period (FY) |
2003 – 2004
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2004)
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| Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | X線結晶構造解析 / 2原子酸素添加酵素 / 反応中間体構造 / エクストラジオール型 / 芳香族分解系 / ノンヘム鉄 / 阻害剤 / 配位構造 / 反応機構 / 反応中間体 / 構造生物学 |
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| Research Abstract |
Extradiol型2原子酸素添加酵素は、芳香族化合物の代謝においてキーとなる酵素で、古くから精力的に研究されてきた。これらの酵素は活性中心に2価のノンヘム鉄を含んでおり、カテコール環に酸素原子を2個付加することで芳香環を開裂する。本研究では、extradiol型2原子酸素添加酵素の反応中間体構造を超高分解能で決定し、extradiol型2原子酸素添加酵素の触媒反応機構を明らかにすることを目指した。
まず超高分解能の結晶構造を決定する為に、BphCの精製度を上げて結晶化を行った。その結果、分解能を1.45Åから1.3Å分解能まであげる事に成功した。この結晶を用いることで、活性中心の詳細な構造を決定する事が出来た。特に、低酸素濃度下で決定した構造では、これまで分子種が不明(O_2もしくはO_2^-である可能性を否定できなかった)であった鉄めリガンドが、OもしくはOHである事がはっきりと示された。また、本研究期間中に共同研究者により、4-メチルカテコールや、4-クロロカテコールが、BphCのユニークな阻害剤である事が示された。この知見は、本酵素の工学的応用に重要であるため、これらの阻害剤の触媒反応阻害機構を立体構造に基づき解析した。これらの阻害剤とBphCとの複合体の高分解能結晶構造の決定を行った結果、驚くべき事にこれらの4位置換阻害剤は、通常の基質と結合様式が全く異なっていることが明らかになった(論文準備中)。具体的には、4位置換の阻害剤の場合は、2つの水酸基が鉄イオンを中心としたOctahedralの配位構造中で共にequatorialの位置を占めていることが明らかになった(基質では、1つの水酸基がaxialに、他方の水酸基がequatorialな位置に結合する)。このような阻害形式は、初めて見いだされたもので極めて興味深い。構造を検討した結果、この異常な結合様式は、基質ポケットの形状に起因するとものと考えられた。この結果、基質結合ポケットの形状を変える事で、特定の基質に対して耐性の(失活しにくい)酵素を設計できる可能性があることが示された。
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