tRNAのアンチコドンゆらぎ塩基への硫黄・セレン挿入機構

• Project/Area Number: 15780070
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 三原 久明 京都大学, 化学研究所, 助手 (30324693)
• Project Period (FY): 2003 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000); Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2004: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2003: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: tRNA / 修飾塩基 / アンチコドン / 硫黄 / システインデスルフラーゼ / ATP / システイン / 5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン

Research Abstract

tRNAの修飾塩基である5-メチルアミノメチル-2-チオウリジン(mnm^5s^2U)は、tRNAのアンチコドンのゆらぎ塩基に特異的に存在し、アミノアシル化およびリボソーム上での翻訳の効率化にとって重要な役割を担っている。本研究ではmnm^5s^2Uとその誘導体である5-メチルアミノメチル-2-セレノウリジン(mnm^5se^2U)の生合成に関与するシステインデスルフラーゼとセレノリン酸シンテターゼ、tRNA硫黄転移酵素(MnmA)の機能解析を目的とした。
(1)2-チオ化活性
未修飾tRNA^<Lys>を、IscS、野生型および変異型MnmA、[^<35>S]-L-システイン、MgATP、ジチオスレイトール(DTT)とともにインキュベーションし、ホスフォイメージャーを用いて^<35>Sで標識されたtRNAを検出した。その結果、D17A、C102A、C199Aを用いた反応では^<35>S標識tRNAは生成されず、Asp17、Cys102、Cys199がMnmAの酵素活性にとって重要な残基であることが明らかとなった。
(2)IscSからMnmAへの硫黄転移反応
^<35>S標識ペルスルフィド型IscSを野生型および変異型MnmAとインキュベーションし、PAGEで分離後、ホスフォイメージャーを用いて^<35>S標識MnmAを検出した。その結果、野生型酵素およびC199Aと比較して、C102Aに転移した硫黄の量は著しく少ないことが明らかとなった。この結果より、Cys102がペルスルフィド型IscSから硫黄を受け取る残基であると考えられた。
(3)AMP生成反応
本酵素反応により生成するATP分解産物を、HPLCを用いて分析した。野生型MnmAをMgATPのみとインキュベーションした場合と比べて、この反応液にtRNA、IscS、L-システインを添加した場合にAMPの生成量が著しく増加した。このことは、本酵素反応において、tRNAがアデニル化される可能性を示唆している。
以上の結果より、以下のような反応機構が考えられた。
ペルスルフィド型IscSの硫黄はMnmAのCys102に転移する。一方で、MnmAはATPを用いてtRNAの34番目のウリジンの2位の酸素をアデニル化により活性化する。Cys102上のペルスルフィドの硫黄、または遊離した硫黄がピリミジン環の2位炭素を求核攻撃してAMPが遊離し、最終的にs^2Uが生成する。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structures of Δ^1-piperideine-2-carboxylate/Δ^1-pyrroline-2-carboxylate reductase belonging to a new family of NAD(P)H-dependent oxidoreductases (2005)
  • Author(s): Goto, M.
  • Journal Title: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 280・ 49 Pages: 40875-40884
• [Journal Article] N-Methyl-L-amino acid dehydrogenase from Pseudomonas putida - A novel member of an unusual NAD(P)-dependent oxidoreductase superfamily (2005)
  • Author(s): Mihara, H.
  • Journal Title: FEBS JOURNAL 272・5 Pages: 1117-1123
• [Journal Article] A new family of NAD(P)H-dependent oxidoreductases distinct from conventional Rossmann-fold proteins (2005)
  • Author(s): Muramatsu, H.
  • Journal Title: JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING 99・6 Pages: 541-547
• [Journal Article] N-Methyl-L-amino acid dehydrogenase from Pseudomonas putida, a novel member of unusual NAD(P)-dependent oxidoreductase superfamily (2005)
  • Author(s): Mihara, H
  • Journal Title: FEBS J 272・5 Pages: 1117-1123
• [Journal Article] The putative malate/lactate dehydrogenase from Pseudomonas putida is a NADPH-dependent deltal-piperideine-2-carboxylate/deltal-pyrroline-2-carboxylate reductase involved in the catalolism of D-lysine and D-proline (2005)
  • Author(s): Muramatsu, H
  • Journal Title: J Biol Chem 280・7 Pages: 5329-5335
• [Journal Article] Expression analysis of mammalian selenocysteine lyase (2004)
  • Author(s): Kurokawa, S
  • Journal Title: Biomed Res Trace Elements 15・3 Pages: 278-280
• [Journal Article] Enzymatic synthesis of N-methyl-L-phenylalanine by a novel enzyme, N-methyl-L-amino acid dehydrogenase, from Pseudomonas putida (2004)
  • Author(s): Muramatsu, H
  • Journal Title: Tetrahedron-Asymmetry 15・18 Pages: 2841-2843
• [Publications] Kwak, MS: "A novel regulatory function of selenocysteine lyase, a unique catalyst to modulate major urinary protein"J.Mol.Catal.B-ENZYM.. 23・2-6. 367-372 (2003)
• [Publications] Kurihara, T: "Assembly of Iron-Sulfur Clusters Mediated by Cysteine Desulfurases, IscS, CsdB and CSD, from Escherichia coli"Biochem.Biophys.Acta-PROTEINS PROTEOM.. 1647・1-2. 303-309 (2003)