| Project/Area Number |
15780219
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Applied molecular and cellular biology
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
菅原 肇 独立行政法人理化学研究所, コミュニケーション分子機構研究チーム, 研究員 (70360568)
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| Project Period (FY) |
2003 – 2004
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2004)
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| Budget Amount *help |
¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
Fiscal Year 2003: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
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| Keywords | サイトカイニン / シグナル伝達 / 二成分制御系 / 結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
平成15年度はレスポンスレギュレーター(RR)について、トウモロコシ由来(ZmRR)のアイソフォームZmRR1、ZmRR2の大量発現系の構築がうまくいかなかったため、平成16年度は、異なるアイソフォームの発現系の構築を目指した。その結果、アミノ末端にヒスチジンタグをつけたZmRR3について、大量のサンプルを確保することが可能となった。しかし、このアイソフォームは非常に不安定で、精製したその日から蛋白質が変性し始めていた。4℃で結晶化条件を検索したが、微結晶すら得ることができなかったため、蛋白質の安定化剤であるグリセロールやエチレングリコールをサンプルに添加し、同じく4℃で結晶化条件を検索してもうまくいかなかった。またアイソフォームのヒスチジンタグをプロテアーゼで除去することによって安定性の向上を目指したが、温度が低いとタグがうまく切れず、室温付近で酵素処理すると、アイソフォームがほとんど変性してしまうため、うまくいかなかった。
酵母由来のhistidine phospho-transfer protein(HPt)とRRとの蛋白質-蛋白質複合体の立体構造の報告を元に、ドッキングシミュレーションプログラムを用いてトウモロコシ由来のHPt(ZmHP)とZmRRの複合体モデルの構築を試みた。ZmHPの立体構造は、結晶解析によって実験的に得られたものであるのに対して、ZmRRについては、ホモロジーモデリング法によってin silicoで得られたものであるため、得られたモデルについて、リン酸基を授受するヒスチジン(ZmHP)、アスパラギン酸(ZmRR)周辺を見ると、両蛋白質が接触するinterfaceに隙間が空いており、モデルとしての信頼性に疑問の余地がある。
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