構造生物学的なAMF-AMFR複合体の解明およびその応用

Research Project

Project/Area Number	15790044
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Biological pharmacy
Research Institution	Gifu Pharmaceutical University
Principal Investigator	羽賀新世岐阜薬科大学, 薬学部, 助手 (30311905)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000) Fiscal Year 2004: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000) Fiscal Year 2003: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Keywords	AMF / AMFR / MMPs / N-糖側鎖
Research Abstract	腫瘍由来の細胞運動刺激因子であるオートクラインモティリティファクター(AMF)の受容体であるAMFrの構造生物学的な知見を得るために、大量精製に有利な原核生物による発現系の構築を試みた。 AMFrのヒト完全長、247-、313-、323-、340-、359-、392-C末端およびマウス完全長、219-、279-、322-C末端をそれぞれコードするcDNAを単離し、BamHI、EcoRIあるいはXhoIの切断サイトを5'および3'末端にデザインした遺伝子としてプラスミドに保持させた。これらを大腸菌発現プラスミドに組換え、発現を試みた結果、完全長cDNAでは如何なる発現系を用いても成功しなかった。しかしヒトAMFrのロイシンジッパー、RNGH2モチーフおよびC-末端領域を有する247E-C末端およびC-末端領域のみをコードする392E-C末端のそれぞれのcDNAはGST融合発現系によって大腸菌B株に発現させることに成功した。また宿主大腸菌に予め数種類のシャペロンを過剰発現させたところdnaK-danJ-grpEを共発現させた株に於いて可溶性が向上した。融合GSTを切断して精製したこれらのAMFrには糖鎖が付加しておらず、AMF刺激による細胞運動促進には拮抗しなかった。 247E-C末端タンパクは大腸菌培養時、破砕後の可溶化時などに亜鉛を添加すると発現・可溶性の向上が認められた。また亜鉛を添加して精製した247E-C末端タンパクには亜鉛原子が結合していることを確認した。この効果はロイシンジッパー、RNGH2モチーフを含まない392E-C末端タンパクでは得られなかった。いくつかのヒト由来の白血病細胞株にAMFrの発現がみられないことを発見した。しかしこれらの細胞株にAMFを曝露させると分化の誘導が起こる。そこでAMFr遺伝子を導入して発現させたところ、AMF刺激による細胞運動促進がみられ反対に分化誘導は起こりにくくなった。従ってAMFrとは異なる受容体とシグナリングの存在が示唆された。