架橋試薬を用いたレクチン-糖タンパク質間相互作用の解析

• Project/Area Number: 15790048
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 荒田 洋一郎 帝京大学, 薬学部, 講師 (90246017)
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2004: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2003: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: レクチン / ガレクチン / 糖タンパク質 / 架橋 / 相互作用 / 糖鎖 / β-ガラクトシド

Research Abstract

レクチンと糖タンパク質の相互作用は生体内で非常に重要な役割を担っているが、ガレクチンのように弱い相互作用をするものもある。このため重要な生理機能をもつ生体内リガンドが従来のアフィニティカラムなどによる単離法では同定されていない可能性がある。本研究ではレクチンとリガンド糖タンパク質の架橋試薬による架橋法を確立し、新たな生体内リガンドの単離をめざした。
ヘテロな認識タンパク質としての機能が予想されているガレクチンLEC-1は同一ポリペプチド内に2箇所の糖結合ドメインを繰り返しもっている。X線結晶解析のデータから、タンパク質の外側表面を向いていてかつ親水性であり、糖結合部位に比較的近い(認識されている糖タンパク質との結合は妨げず、かつ2価性架橋試薬により架橋が可能になりそうな位置を予測する)アミノ酸をN末端側レクチンドメイン、C末端側レクチンドメインより8個ずつ選んだ。まず初めに、変異導入後の塩基配列再確認が容易に行えるよう、LEC-1のcDNAに2箇所塩基配列置換を導入し(アミノ酸配列は変化させない)、各レクチンドメインそれぞれについて別々の鋳型を用いてCys残基導入の変異が行えるようにした。これを新たな鋳型として、選んだアミノ酸1箇所ずつをCysに置換したCys残基導入LEC-1のcDNAを16種類(各ドメインごとに8種類ずつ)の構築を行った。さらにこれらのCys残基導入LEC-1のcDNAを蛋白質発現用プラスミドpET21aに導入し、発現用プラスミド16種類を構築した。現在は変異導入LEC-1の大量発現、精製、及び架橋試薬による反応条件を検討中である。

Research Products

• [Journal Article] Immunohistochemical study on the galectins in skin of human and chick and cuticle of Caenorhabditis elegans. (2004)
  • Author(s): Akimoto, Y., Hirabayashi, J., Arata, Y., Kasai, K., Hirano, H., Kawakami, H.
  • Journal Title: Trends Glycosci.Glycotechnol. 16(5)
• [Publications] Pelletier, I., et al.: "Specific recognition of Leishmania major poly-β-galactosyl epitopes by galectin-9 : possible implication of galectin-9 in interaction between L.major and host cells"J.Biol.Chem.. 278(25). 22223-22230 (2003)
• [Publications] 笠井献一, et al.: "ガレクチン"蛋白質核酸酵素. 48(8). 1085-1091 (2003)
• [Publications] 平林 淳, et al.: "フロンタルアフィニティークロマトグラフィー"蛋白質核酸酵素. 48(8). 1206-1212 (2003)
• [Publications] Hirabayashi, J., et al.: "Frontal affinity chromatography as a tool for elucidation of sugar recognition properties of lectins"Methods Enzymol.. 362. 353-368 (2003)