老化に伴うシナプス糖タンパク質変化の網羅的解析とシナプス機能変化の関係の解明

• Project/Area Number: 15790064
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology
• Principal Investigator: 佐藤 雄治 (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団, 東京都老人総合研究所, 研究員 (90280768)
• Project Period (FY): 2003 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000); Fiscal Year 2005: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2004: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000); Fiscal Year 2003: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 老化 / シナプス / シアロ糖タンパク質 / レクチン / MALDI-TOF / MS / 糖蛋白質 / 2次元電気泳動 / 質量分析計 / シナプトソーム / 海馬 / 糖タンパク質

Research Abstract

これまでに、2次元電気泳動とレクチンブロッティングを用いて、老化に伴うシアロ糖タンパク質の変化を検出してきたが、2次元電気泳動におけるサンプルの可溶化やゲル内消化産物の質量分析計による同定の段階での回収率低下のため検出感度が十分に得られず同定には至らなかった。そこで本年度は、この問題を解析するために、シナプトソーム画分を分画することなく直接酵素消化にかけ、シアル糖ペプチドをレクチンカラムにより精製し質量分析計することで、精製の手順を簡素化し、糖ペプチドの回収率を向上させる方法を開発し、更に多段階MS^nを行なうことで、糖ペプチド糖鎖の構造解析と、糖タンパク質の同定を試みた。更にこのシステムを用いて老化に伴うシアロ糖ペプチドの変化を解析した。
標準シアロ糖タンパク質としてヒトトランスフェリン約1nmolを用い、このプロテアーゼ消化物を、Siaα2-6結合を特異的に認識するSNAレクチンを用いて精製し、MALDI-TOF/MSを用いて解析した。この糖タンパク質は2ケ所のアスパラギン結合型糖鎖による修飾部位が存在するが、リシルエンドペプチダーゼにより消化することで、理論値と一致する糖ペプチドが検出され、シアロ糖ペプチドを効率的に回収することができた。このイオンを多段階MS^nにより解析したところ、複合型2本鎖由来の断片イオンが検出され、更にペプチド部分の断片イオンから糖ペプチドの配列が決定し、糖鎖修飾部位の情報が得られた。
この方法を用いて若齢(9週齢)、老齢(30月齢)のラット海馬由来のシナプトソーム画分を解析したところ、質量数2800付近に若齢ラット特異的なイオンが検出された。今後これらを同定することで、老化に伴うシナプス表面の変化が分子レベルで明らかになると期待される。

Research Products

• [Journal Article] Sialylation Enhances the Secretion of Neurotoxic Amyloid-β Peptides. (2006)
  • Author(s): Nakagawa K. et al.
  • Journal Title: Journal of Neurochemistry 96・4 Pages: 924-933
• [Journal Article] Comparison of hippocampal synaptosime proteins in young-adult and aged rats. (2005)
  • Author(s): Sato Y.et al.
  • Journal Title: Neuroscience Letters 382・1-2 Pages: 1-8
• [Journal Article] Cross-Linking of CD45 on suppressive/Regulatory T Cells Leads to the Abrogation of Their Suppressive Activity In Vitro. (2005)
  • Author(s): Shimizu J. et al.
  • Journal Title: Journal of Immunology 174・7 Pages: 4090-4097
• [Journal Article] Comparison of hippocampal synaptosome proteins in young-adult and aged rats (2005)
  • Author(s): Sato Y et al.
  • Journal Title: Neuroscience Letters (In press)
• [Journal Article] ポストゲノム研究としてのプロテオミックス (2005)
  • Author(s): 佐藤 雄治, 遠藤玉夫
  • Journal Title: 腎と透析 58巻・3号 Pages: 283-287