等温遺伝子増幅法を応用したチェアーサイドでの歯周病細菌簡易検査法の確立

Research Project

Project/Area Number	15791237
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Periodontal dentistry
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	前田博史岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (00274001)
Project Period (FY)	2003 – 2004
Project Status	Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help	¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000) Fiscal Year 2004: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2003: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Keywords	歯周病細菌検査 / 等温遺伝子増幅法 / 歯周病細菌 / 16SリボゾーマルRNA遺伝子 / LAMP / Porphyromonas gingivalis / 16S ribosomal RNA / 目視判定
Research Abstract	細菌検査は歯周病の病態を診断し,治療方針を決定する上で重要である。現在はPCR法を中心とした検査法が細菌検査の主流となっている。PCR法は従来の培養法にくらべ迅速性や感度にすぐれた方法である。しかし,歯科治療に臨床応用するには依然としてより迅速かつ簡便な細菌検査法の確立が望まれている。等温遺伝子増幅法(LAMP法)は等温で遺伝子増幅反応が継続するために遺伝子増幅効率が非常に高い。このため,LAMP法を応用することで迅速な細菌検査法を確立することが期待できる。本研究ではLAMP法を応用した歯周病細菌検査システムを開発するために以下の研究を行った。 1.LAMP用プライマーの設計主要な歯周病細菌A.actionmycetemcomitans, P.gingivalis, T.denticola, F.nucleatum, P.intermediaそしてT.forsythiaの16SリボゾーマルRNA遺伝子の塩基配列からそれぞれの菌種に特異的な配列を選択してLAMP用プライマーを設計した。設計にはPrimer Explorer(Fujitsu)を使用した。 2.LAMP反応条件の設定設計したプラィマーを用いてLAMP反応を行い,至適反応温度を調べた結果,64℃で反応させた場合に最も遺伝子の増幅効率が高かった。 3.特異性・検出感度の検討各菌種に対するプライマーの特異性を調べた結果,すべてのプライマーは特異的に標的細菌の遺伝子のみを増幅させることが確認できた。またLAMP法による各細菌種の検出感度は10^2レベルであることが分かった。 4.増幅遺伝子の検出方法の検討増幅遺伝子産物の検出方法として,電気泳動法,リアルタイムモニタリング法さらに目視判定法を検討した。結果,いずれの方法をもちいても増幅産物の検出が可能であることが分かった。以上の結果からLAMP法を応用した歯周病細菌検査の有用性が示された。