糖質酵素に見出された新しい機能を発揮させる構造因子の分子機構とその応用
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15F15090
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 外国 |
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| Research Field |
Applied biochemistry
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
木村 淳夫 北海道大学, 農学研究院, 教授 (90186312)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
MANEESAN JANJIRA 北海道大学, 農学研究院, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2017-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2016)
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| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 2016: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 2015: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
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| Keywords | 糖質酵素 / 高基質濃度 / 伸長作用 / 阻害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的は、花バチのスクラーゼ（SUCase）と多糖合成酵素（PSase）が示す新しい現象の分子解析と応用である。SUCaseの優れた特徴は基質阻害と生成物阻害が極めて低く「高基質濃度で活発に反応できる点」にある。この低阻害に関わる構造因子を決定し、高基質濃度で高活性な酵素を作製する。PSaseは多糖を糖転移と糖鎖伸長で合成するが、我々は「両反応が別個の部位で生じる」と推測した。その理由は、C末端領域を除去すると糖鎖伸長のみが低下したからである。現在、支持されている機構は「両反応が活性部位の１箇所で触媒」である。C末領域の糖鎖伸長に関わる構造因子を決定し、一般説を精査する。また、新規サイズの糖質を生産できる有用PSaseを作製する。
SUCaseの阻害解除現象に関与する残基としてGlnとLeuを昨年度明らかにした。さらにTyrを含めた多重変異体を評価した。GlnとLeu、TyrとGln、LeuとTyrの各置換による２重変異酵素、Gln・Leu・Tyrを置換した３重変異酵素を作製した。高濃度ショ糖への活性を測定すると、Gln→Asn／Leu→Hisに親酵素より大きい阻害解除が観察され、基質阻害や生成物阻害を低減させた置換酵素の取得に成功した。一方、立体構造は得られなかったが、相同酵素の構造からGlnとLeuは活性部位の近傍に存在が推定された。相同酵素の塩依存性活性化も解析した。
PSaseのC末端除去実験から候補アミノ酸を推定した。変異導入により伸長反応が低下したので、本残基を糖鎖伸長の第２の構造因子と推察した。しかし、完全に伸長現象が消失していないので、さらなる構造因子の存在が考えられる。生成物のサイズ分析から長鎖型オリゴ糖の生成を確認した。酵素結晶が得られなかった。その理由として分子量が10万を超える巨大タンパク質であることが考えられた。転移の新たな反応機構を提案した。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
