低分子量G蛋白質Arf6経路に着目した網膜リボンシナプスの分子解剖学

• Project/Area Number: 15H04672
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: General anatomy (including histology/embryology)
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 阪上 洋行 北里大学, 医学部, 教授 (90261528)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000); Fiscal Year 2018: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2017: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2016: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2015: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
• Keywords: リボンシナプス / 小胞輸送 / 光感受細胞 / 視細胞 / 光受容 / 低分子量Gタンパク質 / 網膜 / シナプス / ジストロフィン / 低分子量GTP結合タンパク質 / 視覚

Outline of Annual Research Achievements

シナプスリボンは、網膜視細胞などの感覚神経細胞のシナプス前側に存在する高電子密度構造物で、感覚刺激に反応した持続的な神経伝達物質の放出に関与するものと考えられている。しかしながら、分子構成や機能的役割に関して多くの未解決な点が残されている。本研究は、申請者らの新規シナプスリボン構成分子としての低分子量G蛋白質ADPリボシル化因子(Arf)活性化制御因子BRAG1の発見（Katsumata et al., 2009）から着想したもので、網膜シナプスリボンにおけるArf経路の機能解明と分子ネットワークの解明を研究目的とする。本年度は実験計画に従って以下の研究成果をあげた。
(1)リボンシナプスにおけるArf6活性化制御因子BRAG2aの局在機構の解明：
リボンシナプスにおいて、BRAG2のアイソフォームであるBRAG2aが、視細胞のシナプス終末の突起先端部において局在することを免疫電子顕微鏡解析により微細構造レベルで明らかにした。さらに、GSTプルダウン法、免疫沈降法、in situ proximity ligation法などの多角的な解析方法によりBRAG2aが視細胞においてジストロフィン複合体とリボンシナプスにおいて複合体を形成することを明らかにした。さらに、視細胞で発現するジストロフィンDp426, Dp260, Dp140を欠損したExon52ノックアウトマウスの網膜の視細胞において、BRAG2aの発現が著明に減少することを見出し、BRAG2aの局在機構の一端を明らかにした（Sakagami et al., 2017）。
(2) 視細胞特異的BRAG1ノックアウトマウスの樹立：BRAG1の視細胞における視覚シグナル伝達やリボンシナプス形成における機能を明らかにするために、BRAB1(flox)マウスと錐体・杆体細胞においてCreリコンビナーゼを発現するCrx-Creトランスジェニックマウスの交配により、視細胞特異的BRAG1ノックアウトマウスの樹立を進行している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

リボンシナプスにおけるBRAG2aの局在機構を明らかにし、論文発表して成果を挙げた。BRAG1ノックアウトマウスを用いた視覚情報伝達における機能解析に関しては、全身ノックアウトマウスにおける出産や養育行動の問題から実験に必要な仔が得られず実験計画がやや遅延している。視細胞特異的BRAG1ノックアウトマウスの樹立し、網膜電図による解析と電子顕微鏡によるリボンシナプス形成における役割の解明の完遂を目指す。

Strategy for Future Research Activity

BRAB1(flox)マウスと錐体・杆体細胞においてCreリコンビナーゼを発現するCrx-Creトランスジェニックマウスの交配により、視細胞特異的BRAG1ノックアウトマウスを樹立し、網膜電図による解析と電子顕微鏡によるリボンシナプス形成における役割の解明の完遂を目指す。また、酵母ツーハイブリット法により見出したシナプスリボン構成タンパク質の候補分子のシナプスリボンでの発現解析を施行する。

Research Products

• [Journal Article] BRAG2a, a guanine nucleotide exchange factor for Arf6, is a component of the dystrophin-associated glycoprotein complex at the photoreceptor terminal. (2017)
  • Author(s): Sakagami H, Katsumata O, Hara Y, Sasaoka T, Fukaya M
  • Journal Title: Investigative Ophthalmology and Visual Science(IOVS) Volume: 58 Issue: 9 Pages: 3795-3795
  • DOI: 10.1167/iovs.17-21746
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cellular and subcellular localization of ADP-ribosylation factor 6 in mouse peripheral tissues (2017)
  • Author(s): Katsumata Osamu、Mori Momoko、Sawane Yusuke、Niimura Tomoko、Ito Akiko、Okamoto Hirotsugu、Fukaya Masahiro、Sakagami Hiroyuki
  • Journal Title: Histochemistry and Cell Biology Volume: 148 Pages: 577-596
  • DOI: 10.1007/s00418-017-1599-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] CDKL5 controls postsynaptic localization of GluN2B-containing NMDA receptors in the hippocampus and regulates seizure susceptibility (2017)
  • Author(s): Okuda K, Kobayashi S, Fukaya M, Watanabe A, Murakami T, Hagiwara M, Sato T, Ueno H, Ogonuki N, Komano-Inoue S, Manabe H, Yamaguchi M, Ogura A, Asahara H, Sakagami H, Mizuguchi M, Manabe T, Tanaka T
  • Journal Title: Neurobiology of Disease Volume: 106 Pages: 158-170
  • DOI: 10.1016/j.nbd.2017.07.002
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Data on the effect of knockout of cytohesin-1 in myelination-related protein kinase signaling (2017)
  • Author(s): Ruri Tsuneishi, Naoto Matsumoto, Misa Itaoka, Yuki Urai, Minami Kaneko, Natsumi Watanabe, Shou Takashima, Yoichi Seki, Takako Morimoto, Hiroyuki Sakagami, Yuki Miyamoto, and Junji Yamauchi
  • Journal Title: Data Brief Volume: 15 Pages: 234-239
  • DOI: 10.1016/j.dib.2017.09.024
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Co-localization of endogenous Arf6 and its activator EFA6D in the granular convoluted tubule cells of mouse submandibular glands under normal conditions and when stimulated by isoproterenol, noradrenaline and carbachol. (2017)
  • Author(s): Tachow A, Thoungseabyoun W, Phuapittayalert L, Petcharat K, Sakagami H, Kondo H, Hipkaeo W.
  • Journal Title: Arch Oral Biol. Volume: 82 Pages: 153-159
  • DOI: 10.1016/j.archoralbio.2017.06.007
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Distinct subcellular localization of alternative splicing variants of EFA6D, a guanine nucleotide exchange factor for Arf6, in the mouse brain (2016)
  • Author(s): Fukaya M, Ohata S, Hara Y, Tamaki H, Sakagami H.
  • Journal Title: Journal of Comparative Neurology Volume: 477 Pages: 2531-2552
  • DOI: 10.1002/cne.24048
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Expression of β subunit of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I in the developing rat retina. (2016)
  • Author(s): Jusuf AA, Sakagami H, Kikkawa S, Terashima T.
  • Journal Title: Kobe Journal of Medical Sciences Volume: 61
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Polyhydramnios in Lrp4 knockout mice with bilateral kidney agenesis: Defects in the pathways of amniotic fluid clearance (2016)
  • Author(s): Tanahashi, H.;Tian, Q.B.; Hara, Y.;Sakagami, H.;Endo, S.;Suzuki, T.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 20241-20241
  • DOI: 10.1038/srep20241
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Interaction of serologically defined colon cancer antigen-3 with Arf6 and its predominant expression in the mouse testis. (2016)
  • Author(s): Sakagami H, Hara Y, Fukaya M.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 477 Pages: 868-873
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.06.150
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ADP rebosylation factor 6 regulates neuronal migration in the developing cerebral cortex thruough FIP2/Arfophilin-1-dependent endosomal trafficking of N-cadherin (2016)
  • Author(s): Yoshinobu Hara, Masahiro Fukaya, Kanehiro Hayashi, Takeshi Kawauchi, Kazunori Nakajima, and Hiroyuki Sakagami
  • Journal Title: eNeuro Volume: 3 Pages: 1-20
  • DOI: 10.1523/eneuro.0148-16.2016
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Targeted disruption of the mouse protein phosphatase ppm1l gene leads to structural abnormalities in the brain (2016)
  • Author(s): Kusano, R., Kousuke Fujita, K., Yasuharu Shinoda, Y., Nagaura, Y., Kiyonari, H., Abe, T, Watanabe, T., Matsui, Y., Fukaya, M., Sakagami, H., Sato, T., Funahashi, J.-I., Ohnishi, M., Tamura, S., Kobayashi, T.
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 590 Pages: 3603-3615
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12429
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Arf6 mediates Schwann cell differentiation and myelination. (2016)
  • Author(s): Tomohiro Torii, Yuki Miyamoto, Masahiro Yamamoto, Katsuya Ohbuchi, Hideki Tsumura, Kazuko Kawahara, Akito Tanoue, Hiroyuki Sakagami, and Junji Yamauchi
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 465 Pages: 450-457
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.08.038
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Arf6 guanine-nucleotide exchange factor cytohesin-2 regulates myelination in nerves. (2015)
  • Author(s): Tomohiro Torii, Nobuhiko Ohno, Yuki Miyamoto, Kazuko Kawahara, Yurika Saitoh, Kazuaki Nakamura, Shou Takashima, Hiroyuki Sakagami, Akito Tanoue, and Junji Yamauchi
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 460 Pages: 819-825
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.03.113
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. (2015)
  • Author(s): Yoshinori Shirai, Masahiko Watanabe, Hiroyuki Sakagami and Tatsuo Suzuki
  • Journal Title: J Neurochem. Volume: 134 Pages: 578-589
  • DOI: 10.1111/jnc.13136
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Stimulation of sigma-1 receptor ameliorates depressive-like behaviors in CaMKIV null mice. (2015)
  • Author(s): Moriguchi, S.;Sakagami, H.;Yabuki, Y.;Sasaki, Y.;Izumi, H.;Zhang, C.;Han, F.;Fukunaga, K.
  • Journal Title: Molecular neurobiology Volume: 52 Pages: 1210-1222
  • DOI: 10.1007/s12035-014-8923-2
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Thromboxane A2 induces blood flow recovery via platelet adhesion to ischaemic regions. (2015)
  • Author(s): Amano H, Ito Y, Eshima K, Kato S, Ogawa F, Hosono K, Oba K, Tamaki H, Sakagami H, Shibuya M, Narumiya S, Majima M.
  • Journal Title: Cardiovascular Research Volume: 107 Pages: 509-21
  • DOI: 10.1093/cvr/cvv139
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The role of vascular endothelial growth factor receptor 1 signaling in the recovery from ischemia. (2015)
  • Author(s): Amano H, Kato S, Ito Y, Eshima K, Ogawa F, Takahashi R, Sekiguchi K, Tamaki H, Sakagami H, Shibuya M, Majima M.
  • Journal Title: PlosOne Volume: 10(7)
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0131445
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 新規cytohesin-2結合分子Pallidinの初期エンドソーム輸送調節と樹状突起形成制御機構 (2018)
  • Author(s): 深谷 昌弘、伊藤 諭子、三枝信太郎 、原 芳伸、阪上 洋行
  • Organizer: 第123回日本解剖学会総会・全国学術集会(東京)
• [Presentation] 新規cytohesin-2結合分子Pallidinの細胞内局在とその機能 (2017)
  • Author(s): 深谷 昌弘、伊藤 諭子、岡本 浩嗣、阪上 洋行
  • Organizer: 第40回日本神経科学大会(千葉）
• [Presentation] 中枢神経系髄鞘形成におけるArf6活性調節因子cytohesin-2の機能 (2017)
  • Author(s): 加倉井俊也, 深谷昌弘, 山内淳司, 阪上洋行
  • Organizer: 第122回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 長崎大学坂本キャンパス(長崎県長崎市）
  • Year and Date: 2017-03-28
• [Presentation] 新規cytohesin-2結合分子Pallidinの生体マウス脳における細胞内局在解析 (2017)
  • Author(s): 深谷昌弘, 小林瑛未, 阪上洋行
  • Organizer: 第122回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 長崎大学坂本キャンパス(長崎県長崎市）
  • Year and Date: 2017-03-28
• [Presentation] 神経細胞の移動におけるRab11-FIP3，FIP4の機能解析 (2016)
  • Author(s): 原 芳伸, 阪上 洋行
  • Organizer: 第39回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-07-20
• [Presentation] Arf6活性制御因子BRAG2cはジストロフィン複合体との相互作用を介して網膜視細胞のシナプスに局在する (2016)
  • Author(s): 阪上 洋行, 深谷 昌弘
  • Organizer: 第39回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-07-20
• [Presentation] シナプス後部におけるBRAG2-Arf6シグナル経路を介したAMPA受容体輸送調節機構 (2016)
  • Author(s): 深谷 昌弘, 阪上 洋行
  • Organizer: 第121回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: ビックパレットふくしま（郡山市）
  • Year and Date: 2016-03-30
• [Presentation] BRAG2-Arf6経路による新たなAMPA受容体シナプス発現調節機構 (2015)
  • Author(s): 阪上 洋行
  • Organizer: BMB2015(第86回日本生化学会大会・第38回日本分子生物学会）
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 (神戸市中央区）
  • Year and Date: 2015-11-07
• [Presentation] BRAG2はendophilin3との相互作用を介してシナプス後部でのArf6の活性化とAMPA型受容体のエンドサイトーシスを調節する (2015)
  • Author(s): 深谷 昌弘, 阪上 洋行
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 (神戸市中央区）
  • Year and Date: 2015-07-28
• [Presentation] ADPリボシル化因子6 (Arf6)は脳層形成において神経細胞の移動を制御する (2015)
  • Author(s): 原 芳伸, 阪上 洋行
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 (神戸市中央区）
  • Year and Date: 2015-07-28
• [Presentation] グリシン作動性ニューロンでCreを発現するマウス系統の開発 (2015)
  • Author(s): 柿崎 利和, 阪上 洋行, 崎村 建司, 柳川 右千夫
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場 (神戸市中央区）
  • Year and Date: 2015-07-28
• [Remarks] 北里大学医学部解剖学(阪上）単位ホームページ
  • URL: http://www.med.kitasato-u.ac.jp/~sakagami/
• [Remarks] 北里大学医学部解剖学（阪上)単位ホームページ
  • URL: http://www.med.kitasato-u.ac.jp/~sakagami/index.php?FrontPage
• [Remarks] 北里大学医学部解剖学(阪上)単位ホームページ
  • URL: http://www.med.kitasato-u.ac.jp/~sakagami/index.php?FrontPage