Research Project
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
＜Polζゲノム科学的解析に必要な分裂酵母株の作成＞リボヌクレオチドを高頻度の取り込むPolζをコードする変異遺伝子の作成に着手した．第一に，Polε，PolδとPolζのカタリティックドメインのアライメントを作成し，Polζの変異されるべきアミノ酸を特定した．その後，Polζをコードする遺伝子（rev3）をプラスミドにクローニング後，当該アミノ酸が変異した遺伝子を作成した．その遺伝子をcre-loxシステムを用いて，分裂酵母の内在のrev3遺伝子と置換した．この酵母を使用して，細胞内での変異Polζの機能を解析した結果，多少の機能低下は観察されるものの，PolζのＤＮＡ合成能は失われていないことが判明した．現在，変異PolζのＤＮＡ合成によるリボヌクレオチドの取り込み定量を行っている．今後は，この株を利用して，ゲノムワイドにPolζ合成領域の特定（Pu-seq）を行う．変異Polζ遺伝子をコードする酵母株の作成と並行して，PolζによるＤＮＡ合成が必要となる細胞株の樹立もおこなった．Polζ欠損株とPolεの機能が低減した株をかけ合せて結果，PolεとPolζの二重変異株において顕著な増殖阻害が観察された．これは，Polε変異体でゲノム中のPolζの合成領域が拡大していることを示している．よって，Polε変異体において，Polζを対象としたPu-seq実験を行い，Polζがリーディング鎖合成を担うPolεを補助する仕組みを今後検証する．＜細胞内でのPolζの１分子レベルでの観察に必要な酵母株の作成＞PALM法を用いて，Polζの細胞内１分子観察を行うため，Polζのカタリティック因子のN末端にｍEos蛍光体が結合した遺伝子の作成に着手した．現在までに，Polζ遺伝子とｍEos遺伝子が結合した配列のプラスミド上へのクローニングが完了し，現在，酵母株への導入を行っている．
27年度が最終年度であるため、記入しない。
All 2015 Other
All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results, Peer Reviewed: 2 results) Presentation (1 results) (of which Invited: 1 results)
Nat. Protocol
Volume: 10 Issue: 11 Pages: 1786-1801
10.1038/nprot.2015.116
Nat. Struct. Mol. Biol.
Volume: 22 Issue: 11 Pages: 932-938
10.1038/nsmb.3100
