新規Ｄｒｅａｍｌｅｓｓ遺伝子に基づくレム睡眠制御機構の解明

• Project/Area Number: 15J00393
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Nerve anatomy/Neuropathology
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 藤山 知之 (2015) 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 特別研究員(PD)
• Research Fellow: 藤山 知之 (2016-2017) 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2017: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2015: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: NALCN / EEG/EMG Recording / REM Sleep / ENU / CRISPR / Central Nervous System / Mouse / Dreamless / Central Neuvous System / レム睡眠 / 一塩基多型

Outline of Annual Research Achievements

平成29年度の研究実績の概要を以下に記載する。
申請者は、Dreamless変異型NALCNがどういった脳領域・神経細胞サブグループにおいてレム睡眠に影響を及ぼすのかを調べるため、特定のプロモーター制御下で発現するCre組換え酵素により（遺伝子改変マウスやAAVベクターを組み合わせたCre/loxPシステム）、任意の部位、時期、細胞種特異的にDreamless変異の誘導を可能にする新規遺伝子改変マウス系統『Nalcn-FLEx』の設計・開発を試みた。Nalcn-FLExマウスの再作製作製は新潟大学﨑村研との共同研究として施行した。
Vglut1-Cre、Vglut2-Cre、Vgat-Creなどの特定の神経細胞サブタイプ特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウス系統の全ての組み合わせにて、In vivo脳における変異型Nalcn遺伝子の発現誘導を確認することができた。当系統を用いてDreamless家系で観察されたレム睡眠の顕著な短縮を再現することができるか検討するため、全身性にDreamless変異を誘導したNalcn-FLExヘテロ変異マウスを作製し、睡眠覚醒を脳波筋電図レコーディングにより計測した。Creのドライバーとしては、ハウスキーピング遺伝子として知られるベータ-アクチンを用いた。その結果、全身性ヘテロ変異の誘導によりDreamless変異マウスと同様の顕著なレム持続時間の減少やレム総時間の低下といった表現型を再現することができた。
今後は、このFLExノックインマウスを用いて、変異型NALCNがどの脳領域で作用しているのか、Dreamless家系のレム睡眠異常を再現しうる特定の細胞種・神経核部位を詳細に解析・探索する。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Vanderbilt University Medical Center/UT Southwestern Medical Center(米国)
• [Int'l Joint Research] UT Southwestern Medical Center(米国)
• [Journal Article] Forebrain Ptf1a is required for sexual differentiation of the brain (2018)
  • Author(s): Tomoyuki Fujiyama, Satoshi Miyashita, Yousuke Tsuneoka, Kazumasa Kanemaru, Miyo Kakizaki, Satomi Kanno, Yukiko Ishikawa, Mariko Yamashita, Tomoo Owa et al.,
  • Journal Title: Cell Reports Volume: Pre-accepted
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need (2018)
  • Author(s): Zhiqiang Wang, Jing Ma, Chika Miyoshi, Yuxin Li, Makito Sato, Yukino Ogawa, Tingting Lou, Chengyuan Ma, Xue Gao, Chiyu Lee, Tomoyuki Fujiyama et al.,
  • Journal Title: Nature Volume: In press
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of mutations through dominant screening for obesity using C57BL/6 substrains (2016)
  • Author(s): Hossain MS., Funato H, and Yanagisawa M et al.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Issue: 1 Pages: 32453-32453
  • DOI: 10.1038/srep32453
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice (2016)
  • Author(s): Funato H and Yanagisawa M et al.
  • Journal Title: Nature Volume: 539(7629) Issue: 46 Pages: 378-383
  • DOI: 10.1038/nature20142
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The retrotrapezoid nucleus neurons expressing Atoh1 and Phox2b are essential for the respiratory response to CO2 (2015)
  • Author(s): Ruffault PL, D'Autreaux F, Hayes JA, Nomaksteinsky M, Autran S, Fujiyama T, Hoshino M, Hagglund M, Kiehn O, Brunet JF, Fortin G, Goridis C.
  • Journal Title: Elife Volume: Apr 13;4
  • DOI: 10.7554/elife.07051
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Forebrain Ptf1a is required for sexual differentiation of the brain (2018)
  • Author(s): Tomoyuki Fujiyama, Satoshi Miyashita, Yousuke Tsuneoka, Kanemaru Kazumasa, Mai Nagaoka, Miyo Kakizaki, Satomi Kanno, Yukiko Ishikawa, Yoshiya Kawaguchi, Yuchio Yanagawa, Mark A. Magnuson, Akira Shibuya, Yo-ichi Nabeshima, Masashi Yanagisawa, Hiromasa Funato and Mikio Hoshino
  • Organizer: 第11回神経発生討論会
• [Presentation] 視床下部Ptf1aは脳の性分化に必要である (2017)
  • Author(s): 藤山知之 宮下聡 恒岡洋右 長岡麻衣 柿崎美代 管野里美 石川有紀子 川口義弥 柳川右千夫 マグヌソンAマーク 鍋島陽一 柳沢正史 船戸弘正 星野幹雄
  • Organizer: 第40回日本神経科学学会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 視床下部Ptf1aは脳の性分化に必要である (2017)
  • Author(s): 藤山知之 宮下聡 恒岡洋右 長岡麻衣 柿崎美代 管野里美 石川有紀子 川口義弥 柳川右千夫 マグヌソンAマーク 鍋島陽一 柳沢正史 船戸弘正 星野幹雄
  • Organizer: 第2回脳と心の研究会
• [Presentation] Hypothalamic Ptf1a is required for sexual differentiation of the brain and behavior (2017)
  • Author(s): Tomoyuki Fujiyama, Satoshi Miyashita, Yousuke Tsuneoka, Kanemaru Kazumasa, Mai Nagaoka, Miyo Kakizaki, Satomi Kanno, Yukiko Ishikawa, Yoshiya Kawaguchi, Yuchio Yanagawa, Mark A. Magnuson, Akira Shibuya, Yo-ichi Nabeshima, Masashi Yanagisawa, Hiromasa Funato and Mikio Hoshino
  • Organizer: Society for Neuroscience 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Forebrain Ptf1a is required for sexual differentiation of the brain (2017)
  • Author(s): Tomoyuki Fujiyama, Satoshi Miyashita, Yousuke Tsuneoka, Kanemaru Kazumasa, Mai Nagaoka, Miyo Kakizaki, Satomi Kanno, Yukiko Ishikawa, Yoshiya Kawaguchi, Yuchio Yanagawa, Mark A. Magnuson, Akira Shibuya, Yo-ichi Nabeshima, Masashi Yanagisawa, Hiromasa Funato and Mikio Hoshino
  • Organizer: The 6th Annual IIIS Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 連鎖解析と全エクソームシーケンスによるDreamless変異家系特異的な一塩基置換の同定とCRISPR/Casによる再現 (2016)
  • Author(s): 藤山 知之、三好 千香、佐藤 牧人、水野 聖哉、柳沢 正史、船戸 弘正
  • Organizer: 第121回日本解剖学会
  • Place of Presentation: ビッグパレットふくしま（福島県郡山市）
  • Year and Date: 2016-03-28
  • Invited
• [Presentation] Identification of a single nucleotide substitution specific to the 
Dreamless mutant mouse by linkage analysis and whole exome sequencing, and its genetic verification by CRISPR (2016)
  • Author(s): 藤山知之 三好千香 佐藤牧人 上田壮志 水野聖哉 高橋智 村本玄紀 浅野冬樹 本多隆利 岩崎加奈子 一久綾 柿崎美代 堀田範子 管野里美 石川有紀子 三浦郁生 鈴木智広 若菜茂晴 ビベククマル ジョセフタカハシ 船戸弘正 柳沢正史
  • Organizer: The 4th Annual IIIS Symposium
  • Place of Presentation: 筑波大学（茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2016-02-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of a single nucleotide substitution specific to the Dreamless mutant mouse pedigree by linkage analysis and whole exome sequencing, and its genetic verification by CRISPR (2015)
  • Author(s): 藤山知之 三好千香 佐藤牧人 上田壮志 水野聖哉 高橋智 村本玄紀 浅野冬樹 本多隆利 岩崎加奈子 一久綾 柿崎美代 堀田範子 管野里美 石川有紀子 三浦郁生 鈴木智広 若菜茂晴 ビベククマル ジョセフタカハシ 船戸弘正 柳沢正史
  • Organizer: Neuroscience 2015, SfN’s 45th Annual Meeting
  • Place of Presentation: シカゴ（米国）
  • Year and Date: 2015-10-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 連鎖解析と全エクソームシーケンスおよびCRISPRによるDreamless変異家系特異的な一塩基置換の同定と再現 (2015)
  • Author(s): 藤山知之 船戸弘正 三好千香 佐藤牧人 水野聖哉 上田壮志 高橋智 村本玄紀 Liu Qinghua 一久綾 堀田範子 柿崎美代 管野里美 石川有紀子 浅野冬樹 本多隆利 三浦郁生 鈴木智広 若菜茂晴 柳沢正史
  • Organizer: 第38回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-07-28
• [Remarks] 筑波大学 IIIS 柳沢・船戸研究室
  • URL: http://sleepymouse.jp/