新型および多機能性テルペン環化酵素の解析を軸としたテルペン創出経路の拡充

• Project/Area Number: 15J03090
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Bioorganic chemistry
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 上田 大次郎 新潟大学, 自然科学系, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2017: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2016: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2015: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: terpenoid / menaquinone

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までの研究においてアセトニル基をもつノルイソプレノイド類（C5 x n + C3）であるC33のファルネシルファルネシルアセトン（FFA）を天然物として初めて単離、同定した。この天然物ファミリーの生合成研究はほとんど行われていない。in vivo, in vitroにおいてスーパーオキシドによって非酵素的な反応が行われている証拠を増やすため、以下の実験を行った。
①スーパーオキシドを分解する酵素（スーパーオキシドディスムターゼ：SOD）の遺伝子破壊株（⊿sodA）の脂質成分を分析したところ野生株よりも菌体あたりのFFAを多く生産した。そこに抗酸化物質（システイン、グルタチオン）を添加し、各々培養を行ったところ、菌体あたりのFFA生産量が両者とも減少した。⊿sodA内で発生したスーパーオキシドを抗酸化物質が消去し、生産されるFFA量が減ったと考えられる。②抗酸化物質（ジブチルヒドロキシトルエン）を添加、けん化処理を行った結果、生産率が減少し、酸素が反応に関与する証拠をさらに得た。③枯草菌でMK-7が基質であることを明確にするため、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素の遺伝子破壊株（⊿HepS/T）を作成し実験を行った。⊿HepS/TはFFAを生産しないのに対し、MK-7を添加すると生産した。MK-7がFFAの前駆体であることが強く示唆された。
また、今回見出した生合成系を利用して、枯草菌によって甲殻類の雄ホルモン（C18）と昆虫フェロモン（C18）を生産する事にも成功した。
本研究は、ノルイソプレノイドの生合成経路として、スーパーオキシドによるビタミンK類（メナキノンやフィロキノン）の非酵素開裂反応を初めて提案したい。ビタミンKは微生物のみならず、ヒトを含めた動物や植物に広く分布しており、そしてスーパーオキシドは全ての生物で発生していると考えられる。この経路は他の生物でも利用されている可能性があると考えている。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure and functional analysis of large-terpene synthase belonging to a newly found subclass (2018)
  • Author(s): Masahiro Fujihashi, Tsutomu Sato, Yuma Tanaka, Daisuke Yamamoto, Tomoyuki Nishi, Daijiro Ueda, Mizuki Murakami, Yoko Yasuno, Ai Sekihara, Kazuma Fuku, Tetsuro Shinada and Kunio Miki,
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 9 Issue: 15 Pages: 3754-3758
  • DOI: 10.1039/c8sc00289d
  • NAID: 120006466632
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Analysis of the Catalytic Mechanism of Bifunctional Triterpene/Sesquarterpene Cyclase:Tyr167 Functions To Terminate Cyclization of Squalene at the Bicyclic Step (2017)
  • Author(s): Liudmila Tenkovskaia, Mizuki Murakami, Kotone Okuno, Daijiro Ueda, Tsutomu Sato.
  • Journal Title: Chembiochem Volume: 18 Issue: 19 Pages: 1910-1913
  • DOI: 10.1002/cbic.201700329
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bioinspired synthesis of pentacyclic onocerane triterpenoids (2017)
  • Author(s): Florian Bartels, Young J. Hong, Daijiro Ueda, Manuela Weber, Tsutomu Sato, Dean J. Tantillo , Mathias Christmann.
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 8 Issue: 12 Pages: 8285-8290
  • DOI: 10.1039/c7sc03903d
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 龍涎香に関する研究 (2017)
  • Author(s): 上田大次郎、佐藤努
  • Journal Title: 香料 Volume: 273 Pages: 53-59
  • NAID: 40021166632
• [Journal Article] Biosynthesis of sesterterpene, head-to-tail triterpene, and sesquarterpene in Bacillus clausii: Identification of multifunctional enzymes and analysis of isoprenoid metabolites (2015)
  • Author(s): Ueda, D., Yamaga, H., Murakami, M., Totsuka, Y., Shinada, T., Sato, T.
  • Journal Title: ChemBiolChem Volume: 16 Issue: 9 Pages: 1710-1714
  • DOI: 10.1002/cbic.201500138
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 龍涎香の主成分アンブレインの酵素合成 (2015)
  • Author(s): 上田大次郎、星野力、佐藤努
  • Journal Title: AROMA RESEARCH Volume: vol.16, No.2 Pages: 42-43
• [Presentation] アセトニル基をもつノルイソプレノイド類の生合成：ビタミンＫの非酵素的開裂 (2018)
  • Author(s): 上田 大次郎、松ヶ根 沙織、岡本 渉、橋本 昌征、佐藤 努
  • Organizer: 日本農芸化学会
• [Presentation] Biosynthesis of Sesterterpenes, Head-to-Tail Triterpenes, and Sesquarterpenes in Bacillus clausii: Identification of Multifunctional Enzymes and Analysis of Isoprenoid Metabolite (2017)
  • Author(s): Daijiro Ueda
  • Organizer: 2nd US-Japan Seminar on the Biosynthesis of Natural Products For Young Researcher
  • Place of Presentation: 東京工業大学大岡山キャンパス（ 東京都目黒区大岡山２丁目１２－１）
  • Year and Date: 2017-03-04
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] マッコウクジラ由来アンブレイン生産菌の探索 (2017)
  • Author(s): 上田大次郎、川邊舞、山田格、田島木綿子、佐藤努
  • Organizer: 第28回セトロジー研究会札幌大会
• [Presentation] スクアレンーアンブレイン環化酵素の創出：アンブレインはスクアレンから2つの経路を通して1つの酵素によって合成できる (2017)
  • Author(s): 上田大次郎、奥野琴音、星野力、佐藤努
  • Organizer: 第69回日本生物工学会大会
• [Presentation] Creation of squalene-ambrein cyclase: ambrein can be synthesized from squalene by one enzyme through two pathways (2017)
  • Author(s): Daijiro Ueda, Kotone Okuno, Mao Inoue, Tsutomu Hoshino and Tsutomu Sato
  • Organizer: KAAB International Symposium 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ポリプレニルアセトン類の生合成：活性酸素によるメナキノンの非酵素的開裂反応 (2016)
  • Author(s): 上田 大次郎, 岡本渉、橋本昌征、佐藤努
  • Organizer: 第60回香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会
  • Place of Presentation: 東京農業大学オホーツクキャンパス（北海道網走市八坂196）
  • Year and Date: 2016-10-29
• [Presentation] ポリプレニルアセトン類の生合成：活性酸素によるメナキノンの非酵素的開裂反応 (2016)
  • Author(s): 上田大次郎、岡本渉、橋本昌征、佐藤努
  • Organizer: 日本農芸化学会関東支部2016年度支部大会
  • Place of Presentation: 日本獣医生命科学大学（東京都武蔵野市境南町１-７-１）
  • Year and Date: 2016-10-15
• [Presentation] ポリプレニルアセトン類の生合成：活性酸素によるメナキノンの非酵素的開裂反応 (2016)
  • Author(s): 上田大次郎、岡本渉、橋本昌征、佐藤努
  • Organizer: 第26回イソプレノイド研究会
  • Place of Presentation: 長崎県立大学 シーボルト校(長崎県西彼杵郡長与町まなび野1-1-1)
  • Year and Date: 2016-09-28
• [Presentation] Biosynthesis of polyprenylacetone: proposal for non-enzymatic cleavage of menaquinone by reactive oxygen species (2016)
  • Author(s): Daijiro Ueda, Wataru Okamoto, Masayuki Hashimoto, Tsutomu Sato
  • Organizer: KAAB International Symposium 2016
  • Place of Presentation: 新潟大学（新潟市西区五十嵐2の町8050番地）
  • Year and Date: 2016-09-28
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Biosynthesis of Sesterterpenes, Head-to-Tail Triterpenes, and Sesquarterpenes in Bacillus clausii: Identification of Multifunctional Enzymes and Analysis of Isoprenoid Metabolite (2016)
  • Author(s): Daijiro Ueda, Hiroaki Yamaga, Mizuki Murakami, Yusuke Totsuka, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato
  • Organizer: International Symposium on Natural Products for the Future 2016
  • Place of Presentation: 徳島文理大学（徳島市山城町西浜傍示180）
  • Year and Date: 2016-09-01
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Biosynthesis of polyprenylacetone: proposal for non-enzymatic cleavage of menaquinone by reactive oxygen species (2016)
  • Author(s): 上田大次郎、岡本渉、橋本昌征、佐藤努
  • Organizer: 第51回天然物化学談話会
  • Place of Presentation: 湯沢東映ホテル(新潟県南魚沼郡湯沢町湯沢3459)
  • Year and Date: 2016-07-06
• [Presentation] 龍涎香主成分ambreinの酵素合成 (2016)
  • Author(s): 上田大次郎、星野力、佐藤努
  • Organizer: セトロジー研究会
  • Place of Presentation: 長岡市寺泊文化センター（新潟県長岡市寺泊磯町 7411-14）
  • Year and Date: 2016-06-25
• [Presentation] ポリプレニルアセトン類の生合成：活性酸素によるメナキノンの非酵素的開裂反応の提唱 (2016)
  • Author(s): 上田大次郎、岡本渉、橋本昌征、佐藤努
  • Organizer: 日本農芸化学会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（札幌市白石区東札幌6条1丁目1-1）
  • Year and Date: 2016-03-28
• [Presentation] Cyclization of squalene from both termini: identification of an onoceroid synthase and enzymatic synthesis of ambrein (2015)
  • Author(s): Daijiro Ueda, Tsutomu Hoshino, Tsutomu Sato
  • Organizer: PACIFICHEM2015
  • Place of Presentation: Sheraton Waikiki Hawai（1801 Kalakaua Ave, Honolulu, HI 96815）
  • Year and Date: 2015-12-18
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Bacillus clausiiにおけるセスタテルペン、Head-to-tailトリテルペンおよびセスクアテルペンの生合成:多機能性酵素の同定とイソプレノイド代謝物の解析 (2015)
  • Author(s): 上田大次郎、山鹿 宏彰、村上 瑞気、 遠塚悠輔、品田哲郎、佐藤 努
  • Organizer: 第67回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 鹿児島城山観光ホテル（鹿児島県鹿児島市新照院町41－1）
  • Year and Date: 2015-10-27
• [Presentation] Biosynthesis of Sesterterpenes, Head-to-Tail Triterpenes, and Sesquarterpenes in Bacillus clausii: Identification of Multifunctional Enzymes and Analysis of Isoprenoid Metabolites (2015)
  • Author(s): Daijiro Ueda, Hiroaki Yamaga, Mizuki Murakami, Yusuke Totsuka, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato
  • Organizer: KAAB International Symposium 2015
  • Place of Presentation: 新潟大学（新潟県新潟市西区五十嵐2の町8050番地）
  • Year and Date: 2015-09-29
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Bacillus clausiiにおけるセスタテルペン、Head-to-tailトリテルペン、セスクアテルペンの生合成:多機能性酵素の同定とイソプレノイド代謝物の解析 (2015)
  • Author(s): 上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 村上 瑞気, 遠塚悠輔, 品田哲郎, 佐藤 努
  • Organizer: 第25回イソプレノイド研究会
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県仙台市青葉区片平二丁目１－１）
  • Year and Date: 2015-09-14
• [Presentation] Bacillus clausiiにおけるセスタテルペン、Head-to-tailトリテルペン、セスクアテルペンの生合成:多機能性酵素の同定とイソプレノイド代謝物の解析 (2015)
  • Author(s): 上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 村上 瑞気, 遠塚悠輔, 品田哲郎, 佐藤 努
  • Organizer: 第59回香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会
  • Place of Presentation: 近畿大学（大阪府東大阪市小若江3ー4ー1）
  • Year and Date: 2015-09-06
• [Presentation] Cyclization of squalene from both termini: identification of an onoceroid synthase and enzymatic synthesis of ambrein (2015)
  • Author(s): Daijiro Ueda, Tsutomu Hoshino, Tsutomu Sato
  • Organizer: Inaugural Symposium of the Phytochemical Society of Asia
  • Place of Presentation: 徳島文理大学（徳島県徳島市山城町西浜傍示180）
  • Year and Date: 2015-08-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Bacillus clausiiにおけるセスタテルペン、Head-to-tailトリテルペンおよびセスクアテルペンの生合成:多機能性酵素の同定とイソプレノイド代謝物の解析 (2015)
  • Author(s): 上田大次郎、山鹿 宏彰、 村上 瑞気、 遠塚悠輔、品田哲郎、佐藤 努
  • Organizer: 第50回天然物化学談話会
  • Place of Presentation: グリーンピア岩沼 モンタナリゾート（宮城県岩沼市北長谷字切通1-1）
  • Year and Date: 2015-07-02
• [Presentation] Bacillus clausiiにおけるイソプレノイド生合成経路：多機能性E型プレニル鎖伸長酵素の同定とセスクアテルペン代謝物の探索 (2015)
  • Author(s): 上田 大次郎、村上 瑞気、山鹿 宏彰、佐藤 努
  • Organizer: 第11回 生合成勉強会（「生合成マシナリー」第七回若手シンポジウム）
  • Place of Presentation: 東京工業大学（東京都目黒区大岡山2-12-1）
  • Year and Date: 2015-06-20
• [Patent(Industrial Property Rights)] アンブレインの製造方法 (2016)
  • Inventor(s): 佐藤努、上田大次郎、星野力
  • Industrial Property Rights Holder: 佐藤努、上田大次郎、星野力
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2016-03-03
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] アンブレインの製造方法 (2016)
  • Inventor(s): 佐藤努、上田大次郎、星野力
  • Industrial Property Rights Holder: 佐藤努、上田大次郎、星野力
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2016-03-17
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] アンブレインの製造方法 (2016)
  • Inventor(s): 佐藤努、上田大次郎、星野力
  • Industrial Property Rights Holder: 佐藤努、上田大次郎、星野力
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2016-02-25
  • Overseas