乳歯歯髄由来ヒトｉＰＳ細胞からの歯髄幹細胞への分化誘導制御

• Project/Area Number: 15J03924
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Orthodontics/Pediatric dentistry
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 村上 智哉 新潟大学, 医歯学系, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2017-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 2016: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 乳歯歯髄細胞 / LEF-1 / 乳歯歯髄幹細胞 / piggyBacトランスポゾン

Outline of Annual Research Achievements

LEF-1は、生物の発生に重要なwnt/β-cateninシグナルにおける転写因子であり、β-cateninを介してwnt標的遺伝子の転写に関わることがわかっている。また、iPS細胞を含めた幹細胞における未分化の維持・増殖に関与することも報告されている。そこで、LEF-1が歯髄幹細胞を含めた未分化な歯系細胞においてマーカーとなるのではと考え本研究においてプロモーターとして採用することとした。
本研究では、LEF-1プロモーターを配したプラスミドベクターとして、遺伝子導入効率が高いとされるpiggyBacトランスポゾン系を採用した。ヒトLEF-1プロモーター＋EGFP cDNA＋抗生物質耐性遺伝子（Neomycin）を挿入したプラスミドpTA-LENを作製した。pTA-LENを乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入行い、薬剤選択およびEGFP発現を指標とし、LEF-1発現細胞を取得し、幹細胞としての可能性について検討することを目的とした。
これまでの研究より、pTA-LENを乳歯歯髄細胞へ遺伝子導入行い薬剤選択後、LEF-1発現細胞を採取することができた。
今年度は、これまでLEF-1発現細胞の神経系および骨系への分化誘導後の評価が不十分であったため、LEF-1発現細胞を分化誘導後にRT-PCR解析を行いmRNAレベルでの評価を行った。結果、代表的な神経芽細胞および骨芽細胞の分化マーカーが検出され、LEF-1発現細胞の多分化能が強く示唆された。加えて、乳歯歯髄細胞由来iPS細胞へpTA-LENを遺伝子導入行った。しかし、薬剤選択時に遺伝子組換えiPS細胞が薬剤耐性フィーダーごと剥がれてしまうことがあり、条件等を変更し培養方法等を検討してきた。薬剤耐性のLEF-1発現iPS細胞を単離することが現時点では十分に確立できておらず、培養方法等の検討を行っていく必要がある。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Isolation and characterization of lymphoid enhancer factor-1-positive deciduous dental pulp stem-like cells after transfection with a piggyBac vector containing LEF1 promoter-driven selection markers. (2017)
  • Author(s): Murakami T, Saitoh I, Sato M, Inada E, Soda M, Oda M, Domon H, Iwase Y, Sawami T, Matsueda K, Terao Y, Ohshima H, Noguchi H, Hayasaki H
  • Journal Title: Archives of Oral Biology Volume: 81 Pages: 110-120
  • DOI: 10.1016/j.archoralbio.2017.04.033
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Tissue-Specific Stem Cells Obtained by Reprogramming of Non-Obese Diabetic (NOD) Mouse-Derived Pancreatic Cells Confer Insulin Production in Response to Glucose. (2016)
  • Author(s): Saitoh I, Sato M, Soda M, Inada E, Iwase Y, Murakami T, Ohshima H, Hayasaki H, Noguchi H.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: １１ Issue: 9 Pages: e0163580-e0163580
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0163580
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Alkaline phosphatase and OCT-3/4 as useful markers for predicting susceptibility of human deciduous teeth-derived dental pulp cells to reprogramming factor-induced iPS cells (2016)
  • Author(s): Inada E, Saitoh I, Miura H, Ohtsuka M, Murakami T, Sawami T, Yamasaki Y, Watanabe S, Aoki R, Sato M
  • Journal Title: Journal of Investigative and Clinical Dentistry Volume: - Issue: 4 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1111/jicd.12236
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Choice of feeders is important when first establishing iPSCs derived from primarily cultured human deciduous tooth dental pulp cells. (2015)
  • Author(s): Saitoh I, Inada E, Iwase Y, Noguchi H, Murakami T, Soda M, Kubota N, Hasegawa H, Akasaka E, Matsumoto Y, Oka K, Yamasaki Y, Hayasaki H, Sato M
  • Journal Title: Cell Medicine Volume: 8 Issue: 1-2 Pages: 9-23
  • DOI: 10.3727/215517915x689038
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] PiggyBac transposon-mediated gene delivery efficiently generates stable transfectants derived from cultured primary human deciduous tooth dental pulp cells (HDDPCs) and HDDPC-derived iPS cells. (2015)
  • Author(s): Inada E, Saito I, Watanabe S, Aoki R, Miura H, Ohtsuka M, Murakami T, Sawami T, Yamasaki Y, Sato M
  • Journal Title: International Journal of Oral Science Volume: 7 Issue: 3 Pages: 144-145
  • DOI: 10.1038/ijos.2015.18
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] The genetic engineering-based isolation of lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF1) positive stem-like cells from human deciduous tooth cell-derived iPSCs (2016)
  • Author(s): Murakami T, Saitoh I, Sato M, Inada E, Soda M, Iwase Y, Sawami T, Suzuki A, Ohshima H, Hayasaki H
  • Organizer: 10th Biennial Conference of the Pediatric Dentistry Association of Asia
  • Place of Presentation: 東京ドームホテル(東京都文京区)
  • Year and Date: 2016-05-26
• [Presentation] The Genetic Engineering-based Isolation of Lymphoid Enhancer-binding Factor-1 (LEF1) Positive Stem-like Cells from Human Deciduous Tooth Cell-derived iPSCs (2016)
  • Author(s): 村上智哉
  • Organizer: 10th Biennial Conference of the Pediatric Dentistry Association of Asia (PDAA)
  • Place of Presentation: 東京ドームホテル（東京都）
  • Year and Date: 2016-05-26
• [Presentation] Genetic engineering-based isolation of deciduous dental pulp stem-like cells (2016)
  • Author(s): 村上智哉
  • Organizer: 45th Annual Meeting & Exhibition of the AADR
  • Place of Presentation: Los Angeles Convention (Los Angeles, Calif, USA)
  • Year and Date: 2016-03-16
• [Presentation] Lymphoid enhancer factor-1 promoterを用いた乳歯歯髄幹細胞様細胞の単離. (2015)
  • Author(s): 村上智哉
  • Organizer: 新潟歯学会第2回例会
  • Place of Presentation: 新潟大学歯学部講堂 (新潟県・新潟市)
  • Year and Date: 2015-11-07
• [Remarks] 新潟大学医歯学総合研究科小児歯科学分野ホームページ
  • URL: http://www.pediatric-dent.net/news/index.html#92