立体構造を基盤に内在性リガンドの探索を目指したヒト由来機能未知ＧＰＣＲの構造解析

• Project/Area Number: 15J04343
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 堀田 彰一朗 京都大学, 医学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2017: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2015: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: X線結晶構造解析 / GPCR / 膜タンパク質 / 抗体

Outline of Annual Research Achievements

標的GPCRの物性評価法の確立
蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー法と熱安定性評価を組み合わせた物性評価法の確立により、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて熱安定性が高く単分散性が良好な標的GPCRのコンストラクトを選別することに成功した。
フィルムサンドウィッチ法の開発
ガラスサンドウィッチ法を用いた脂質メソフェーズ結晶化法においては、得られた結晶がスポンジ相の中に得られた場合、結晶を拾うのに困難が伴う。特に細胞外領域や細胞内領域のドメインが大きい場合またはFab抗体との複合体状態で構造解析を目指す場合、得られる結晶はスポンジ相になりやすい。フィルムサンドウィッチ内に結晶を作製することによりそのままX線を照射できるため結晶を無駄にしなくて済む。フィルムサンドウィッチ内部に作製される結晶の品質を調べた結果、フィルムサンドウィッチ法においてもガラスサンドウィッチ法と同程度の分解能を与える結晶を得ることに成功した。
標的GPCRの構造決定
データセットを可能な限り多く集め構造決定に用いる最終的な回折データセットとした。回折データセット取得の後、Fab化抗体と融合タンパク質、既に登録されている活性型・非活性型GPCRの構造を鋳型として分子置換法を用いることで初期位相の決定を試みた。次に、その後の精密化を通して位相改良とモデルの構築を行い、最終的に3.2オングストロームにおける立体構造の決定に成功し、細胞外領域における構造基盤を明らかにした。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Crystal structure of the human Angiotensin II type-2 receptor bound to an Angiotensin II analog (2018)
  • Author(s): Asada H, Horita S, Hirata K, Shiroishi M, Shiimura Y, Iwanari H, Hamakubo T, Shimamura T, Nomura N, Kusano-Arai O, Uemura T, Suno C, Kobayashi T, Iwata S
  • Journal Title: Nature Structural & Molecular Biology Volume: N.D.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High-resolution crystal structure of the therapeutic antibody pembrolizumab bound to the human PD-1. (2016)
  • Author(s): Horita S, Nomura Y, Sato Y, Shimamura T, Iwata S, Nomura N.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 6 Issue: 1 Pages: 35297-35297
  • DOI: 10.1038/srep35297
  • NAID: 120005850219
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The intervening removable affinity tag (iRAT) production system facilitates Fv antibody fragment-mediated crystallography. (2016)
  • Author(s): Nomura Y, Sato Y, Suno R, Horita S, Iwata S, Nomura N.
  • Journal Title: Protein Sci. Volume: 25 Issue: 12 Pages: 2268-2276
  • DOI: 10.1002/pro.3035
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structure of the ribosomal oxygenase OGFOD1 provides insights into the regio- and stereoselectivity of prolyl hydroxylases. (2015)
  • Author(s): Horita S, Scotti JS, Thinnes C, Mottaghi-Taromsari YS, Thalhammer A, Ge W, Aik W, Loenarz C, Schofield CJ, McDonough MA
  • Journal Title: Structure Volume: 23 Issue: 4 Pages: 639-652
  • DOI: 10.1016/j.str.2015.01.014
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research