ミトコンドリア内膜トランスロケータＴＩＭ２３とＴＩＭ２２複合体の構造生物学的解析

• Project/Area Number: 15J05215
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Kyoto Sangyo University
• Principal Investigator: 松本 俊介 京都産業大学, 総合生命科学部, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2017: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2016: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2015: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: タンパク質分解 / ミトコンドリア / 品質管理 / Msp1 / Cdc48 / Doa10 / Ｘ線結晶解析 / トランスロケータ / TIM23複合体 / TM22複合体 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

本年度は，Msp1とCdc48という２つのAAA-ATPアーゼの役割分担とDoa10による基質のユビキチン化とMsp1およびCdc48による膜引き抜きのどちらが先に起こるステップなのかを決定し，ミスターゲットTAタンパク質の分解機構の全容解明を目指した．まず，野生型酵母において，Msp1の基質のユビキチン化が細胞内のどこで起こるのかを調べた．細胞抽出液をミトコンドリア画分とサイトゾルに分画し，それぞれの画分から基質のユビキチン化を調べたところ，ユビキチン化基質はミトコンドリア画分とサイトゾルの両方に検出された．次に，msp1欠損株において，基質のユビキチン化を調べたところ，基質のユビキチン化はミトコンドリア画分とサイトゾル画分の両方に検出されたが，野生型酵母と比べて，ユビキチン化の効率が大きく低下することがわかった．一方，cdc48温度感受性株を用いて，基質のユビキチン化を調べたところ，ポリユビキチン化された基質はミトコンドリア膜に蓄積することがわかった．共免疫沈降実験によって，Msp1とCdc48のユビキチン化状態に応じた基質との結合を調べたところ，Msp1は非ユビキチン化基質と結合するが，ポリユビキチン化基質との結合は確認できなかった．一方で，Cdc48は非ユビキチン化とポリユビキチン化基質の両方と結合することがわかった．さらに，msp1欠損株を用いて，Cdc48と基質の結合を調べたところ，Cdc48と結合するポリユビキチン化基質の量が大きく減少した．このことから，Msp1は，Doa10による基質のユビキチン化を促進する因子であり，ポリユビキチン化基質をミトコンドリア膜から引き抜くためには，Cdc48が重要であることが示唆された．以上の結果をもとに，申請者は，ミスターゲットTAタンパク質の分解モデルを提唱した．

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Tethering an N-Glycosylation Sequon-Containing Peptide Creates a Catalytically Competent Oligosaccharyltransferase Complex. (2017)
  • Author(s): Matsumoto S, Taguchi Y, Shimada A, Igura M, Kohda D.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 56 Issue: 4 Pages: 602-611
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b01089
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] ミトコンドリア外膜へミスターゲットした膜タンパク質の分解機構の解析 (2017)
  • Author(s): 松本俊介
  • Organizer: ConBio2017
• [Presentation] Analysis of degradation mechanism of mistargeted tail-anchored proteins on mitochondrial outer membrane (2017)
  • Author(s): Shunsuke Matsumoto
  • Organizer: The 42nd FEBS Congress
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Tethering of an N-glycosylation-sequon containing peptide creates a catalytically productive complex of an oligosaccharyltransferase (2016)
  • Author(s): Matsumoto, S., Taguchi, Y., Shimada, A., Igura, M., Kohda, D.
  • Organizer: 14th FASEB Research Conference on “Molecular Biophysics of Membranes”
  • Place of Presentation: Snowmass Colorado（アメリカ）
  • Year and Date: 2016-07-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ミトコンドリア外膜へミスターゲットしたタンパク質の分解機構の解析 (2016)
  • Author(s): 松本俊介，田村康，江崎雅俊，遠藤斗志也
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議（福岡県・福岡市）
• [Presentation] ミトコンドリア外膜へミスターゲットしたタンパク質の分解機構の解析 (2016)
  • Author(s): 松本俊介，田村康，江崎雅俊，遠藤斗志也
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都テルサ（京都府・京都市）
• [Presentation] ミトコンドリア外膜へミスターゲットした膜タンパク質の分解機構の解析 (2016)
  • Author(s): 松本俊介，田村康，江崎雅俊，中務邦雄，遠藤斗志也
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）