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ゲノム編集技術を駆使した疾患モデル両生類作製法の確立

Research Project

Project/Area Number 15J05833
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Laboratory animal science
Research InstitutionHiroshima University

Principal Investigator

坂根 祐人  広島大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2015-04-24 – 2018-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2017)
Budget Amount *help
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2017: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2016: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2015: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Keywordsゲノム編集 / CRISPR-Cas / ツメガエル / 疾患モデル / CRISPR-Cas9 / ネッタイツメガエル
Outline of Annual Research Achievements

本研究では、進行性骨化性繊維異形成症(FOP)モデル両生類の作製に向けて、ネッタイツメガエルにおけるCRISPR-Casシステムを用いたゲノム編集技術の開発を行った。
昨年度に引き続き、ゲノム編集効率を向上させるために、ヌクレアーゼであるCas9とsgRNAをRibonucleoprotein (RNP)として導入する実験を行った。遺伝子破壊の表現型評価が容易な遺伝子を標的とし、ネッタイツメガエル受精卵にCas9 RNPを顕微注入した。F0世代における変異導入効率を正確に算出するために、次世代シークエンサーを用いたアンプリコン解析法を確立した。この方法により、CRISPR-Casシステムを用いて作製した遺伝子破壊個体の標的ゲノム領域を解析したところ、体細胞変異率99%以上であることが分かった。以上の成果より、CRISPR-CasシステムのRNP導入は、ネッタイツメガエルにおいて高効率に標的領域へDNA二本鎖切断を導入できることが示され、ノックイン実験に適当だと判断した。
次に、確立したRNP導入法を用いて、ネッタイツメガエルalk2遺伝子領域に疾患変異型ヒトALK2 cDNAをノックインすることでFOPモデルツメガエルの作製を試みた。Cas9 RNPとノックインベクターを顕微注入した個体からジェノタイピング陽性F0個体を選抜し、性成熟したものから順次掛け合わせを行い、F1世代の作出を試みた。本年度内に、21匹の性成熟した成体が得られ、野生個体と人工媒精あるいはナチュラルメイティングによる掛け合わせを行った。得られた全21クラッチのF1世代個体について、PCRによるジェノタイピングを行ったが、標的領域へノックインは確認できなかった。FOPモデル両生類作製のためには、ノックインされたF1個体が得られなかった原因を明らかにするとともに、さらなる技術改良が必要だと考えられる。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(3 results)
  • 2017 Annual Research Report
  • 2016 Annual Research Report
  • 2015 Annual Research Report
  • Research Products

    (15 results)

All 2017 2016 2015 Other

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 4 results,  Acknowledgement Compliant: 3 results) Presentation (9 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Functional analysis of thyroid hormone receptor beta in Xenopus tropicalis founders using CRISPR-Cas2017

    • Author(s)
      Sakane Y, Iida M, Hasebe T, Fujii S, Buchholz DR, Ishizuya-Oka A, Yamamoto T, Suzuki KT
    • Journal Title

      Biology Open

      Volume: 7 Pages: 1-9

    • DOI

      10.1242/bio.030338

    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Tracking dynamics of histone H3 lysine 9 acetylation in Xenopus laevis tail regeneration2016

    • Author(s)
      Suzuki M, Takagi C, Miura S, Sakane Y, Sakuma T, Sakamoto N, Endo T, Kamei Y, Kimura H, Yamamoto T, Ueno N, Suzuki K
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: Vol.21 (4) Issue: 4 Pages: 358-369

    • DOI

      10.1111/gtc.12349

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders2016

    • Author(s)
      Shigeta, Mitsuki; Sakane, Yuto; Iida, Midori; Suzuki, Miyuki; Kashiwagi, Keiko; Kashiwagi, Akihiko; Fujii, Satoshi; Yamamoto, Takashi; Suzuki, Ken-ichi
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: in press Issue: 7 Pages: 755-771

    • DOI

      10.1111/gtc.12379

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] The Expression of TALEN before Fertilization Provides a Rapid Knock-Out Phenotype in Xenopus laevis Founder Embryos.2015

    • Author(s)
      Miyamoto K, Suzuki K, Suzuki M, Sakane Y, Sakuma T, Herberg S, Simeone A, Simpson D, Jullien J, Yamamoto T, Gurdon JB.
    • Journal Title

      PLOS ONE

      Volume: 10(11) Issue: 11 Pages: e0142946-e0142946

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0142946

    • Related Report
      2015 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] Establishment of CRISPR-Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis for analysis of disease-related genes2017

    • Author(s)
      Sakane Y, Kashiwagi K, Kashiwagi A, Yamamoto T, Suzuki KT
    • Organizer
      The 8th Aquatic Animal Models of Human Disease Conference
    • Place of Presentation
      Birmingham, AL, アメリカ
    • Year and Date
      2017-01-07
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ネッタイツメガエルにおけるsgRNA/Cas9タンパク質複合体を用いた高効率な遺伝子ノックアウト技術の確立2017

    • Author(s)
      坂根祐人・飯田緑・藤井聡・山本卓・鈴木賢一
    • Organizer
      日本ゲノム編集学会第2回大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] Functional analysis of pigment synthesis-related genes in Xenopus tropucalis by genome editing2017

    • Author(s)
      坂根祐人・山本卓・鈴木賢一
    • Organizer
      日本動物学会 第88回 富山大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] Gene knock-out using Cas9 protein in Xenopus tropicalis2016

    • Author(s)
      Sakane Y, Kashiwagi K, Kashiwagi A, Yamamoto T, Suzuki KT
    • Organizer
      第1回ゲノム編集学会
    • Place of Presentation
      広島県広島市
    • Year and Date
      2016-09-06
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] ツメガエル研究におけるゲノム編集2016

    • Author(s)
      坂根祐人, 山本卓, 鈴木賢一
    • Organizer
      第2回次世代両生類研究会
    • Place of Presentation
      愛知県岡崎市
    • Year and Date
      2016-08-08
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] A Simple Protocol for Loss-of-Function Analysis in Xenopus tropicalis founders using the CRISPR-Cas System2016

    • Author(s)
      坂根祐人, 山本卓, 鈴木賢一
    • Organizer
      第10回日本ツメガエル研究集会
    • Place of Presentation
      沖縄県恩納村
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] 両生類研究におけるゲノム編集技術の現状と今後2015

    • Author(s)
      坂根祐人・山本卓・鈴木賢一
    • Organizer
      第9回日本ツメガエル研究集会
    • Place of Presentation
      秋田県秋田市
    • Year and Date
      2015-09-13
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] Genome editing reveals a novel function of keratin in fin formation in Xenopus2015

    • Author(s)
      Yuto Sakane, Tetsushi Sakuma, Keiko Kashiwagi, Yukiko Isoyama, Akihiko Kashiwagi, Makoto Mochii, Takashi Yamamoto, Ken-ichi Suzuki
    • Organizer
      第一回次世代両生類研究会
    • Place of Presentation
      愛知県岡崎市
    • Year and Date
      2015-08-24
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] 両生類研究におけるゲノム編集技術の現状と今後2015

    • Author(s)
      坂根祐人・山本卓・鈴木賢一
    • Organizer
      中四国再生生物学シンポジウム『次世代型器官再生生物学の発展』
    • Place of Presentation
      岡山県岡山市
    • Year and Date
      2015-08-05
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Book] 進化するゲノム編集 第2編 第2章 第2節 ツメガエルにおける編集2015

    • Author(s)
      坂根祐人・山本卓・鈴木賢一
    • Publisher
      (株)エヌ・ティー・エス
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Remarks] ゲノム編集技術と発生工学を組み合わせた 効率の良い遺伝子改変動物の作出方法を開発

    • URL

      http://www.hiroshima-u.ac.jp/top/koho_press/press/h2701-12/p_0aki0u.html

    • Related Report
      2015 Annual Research Report

URL: 

Published: 2015-11-26   Modified: 2024-03-26  

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