Development of a detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein

• Project/Area Number: 15J08615
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Biofunction/Bioprocess
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 李 鎭煕 東京農工大学, 大学院工学府, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2017: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2016: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: ジンクフィンガー蛋白質 / アルカリフォスファターゼ / DNAメチル化 / エピジェネティック修飾 / 電気化学 / DNA検出 / DNA結合蛋白質 / 診断

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではDNAのメチル化を始めとするエピジェネティック修飾を、がんをはじめとする種々の疾患の早期・術中診断の指標として利用することを想定し、アルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質（ALP融合ZFP）の開発、及びそれを用いた検出システムの開発を目的とし、研究を行った。
平成29年度は、ALP融合ZFPを用いた種々の標的DNA検出システムの構築を行った。
まず、ALP融合ZFPによって標的のDNAを検出できるかをプレートアッセイによって確かめた。標的DNAのモデルである大腸菌O157のゲノムDNAを検出したところ、標的DNAの濃度に依存してシグナルが上昇し、10コピーの感度から検出することができた。一方で、標的ではないサルモネラ菌のゲノムDNAを検出した際にはシグナルの上昇が観察されなかったことから特異性にも優れた検出法であることが示された。
また、小型で高感度な標的DNAの検出系を構築するため、チップ電極を用いた標的DNAの電気化学的な検出システムの開発も行った。ここではプレートではなくアビジンビーズ上に標的DNAを固定しALP融合ZFPによる検出を行った。ビーズと基質であるp-aminophenyl phosphateを混合し、酵素反応によって生じる反応生成物をチップ電極上で検出することで、電気化学的に標的DNAの検出を行った。結果として、グルコース脱水素酵素を用いた場合よりも100倍程度高感度に標的DNAを検出することができた。
以上本年度は、ALPを融合したZFPを用いて化学発光、または電気化学的なシグナルに基づく標的DNAの検出システムの構築を行った。昨年度Biosensors and Bioelectronics誌に報告したDNAのメチル化検出法と、本検出法を組み合わせることで、より高感度なDNAメチル化の検出が期待できる。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Universite Claude Bernard Lyon 1(フランス)
• [Int'l Joint Research] Universite Claude Bernard Lyon 1(フランス)
• [Int'l Joint Research] University Lyon 1 - Claude Bernard(フランス)
• [Journal Article] Development of an electrochemical detection system for measuring DNA methylation levels using methyl CpG-binding protein and glucose dehydrogenase-fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics Volume: 93 Pages: 118-123
  • DOI: 10.1016/j.bios.2016.09.060
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] DNA aptamers against FokI nuclease domain for genome editing applications (2016)
  • Author(s): M. Nishio, D. Matsumoto, Y. Kato, K. Abe, J. Lee, K. Tsukakoshi, A. Yamagishi, C. Nakamura and K. Ikebukuro
  • Journal Title: Biosens Bioelectron Volume: 93 Pages: 26-31
  • DOI: 10.1016/j.bios.2016.11.042
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] 2．アプタマーを用いた機能性電極 (2015)
  • Author(s): 李 鎭煕, 池袋 一典
  • Journal Title: Electrochemistry Volume: 83 Issue: 12 Pages: 1085-1090
  • DOI: 10.5796/electrochemistry.83.1085
  • NAID: 130005112140
  • ISSN: 1344-3542, 2186-2451
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 標的DNA検出に向けたアルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質の開発 (2017)
  • Author(s): 李 鎭煕, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, 塚越 かおり, 早出 広司, 池袋 一典
  • Organizer: 電気化学会第84回大会
  • Place of Presentation: 首都大学東京（東京都八王子市）
  • Year and Date: 2017-03-25
• [Presentation] アルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質の開発と標的DNAの検出 (2017)
  • Author(s): 李 鎭煕, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, 塚越 かおり, 早出 広司, 池袋 一典
  • Organizer: 第11回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] Development of alkaline phosphatase fused zinc finger protein for target DNA detection (2017)
  • Author(s): Jinhee Lee, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, Kaori Tsukakoshi, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: XXIV International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Target DNA detection using alkaline phosphatase fused zinc finger protein for diagnosis (2017)
  • Author(s): Jinhee Lee, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, Kaori Tsukakoshi, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: The 44th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of detection system for epigenetic modifications by enzyme fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tatsumi, Yuko Osawa, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: PRiME2016
  • Place of Presentation: USA (Hawaii)
  • Year and Date: 2016-10-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of detection system for epigenetic modifications by enzyme fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tatsumi, Yuko Osawa, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: Biosensors2016
  • Place of Presentation: Sweden (Gothenburg)
  • Year and Date: 2016-05-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of a detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tatsumi, Yuko Osawa, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: 26th Anniversary World Congress on Biosensors
  • Place of Presentation: Swedish Exhibition and Congress Centre, Gothenburg, Sweden
  • Year and Date: 2016-05-25
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of a detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein (2015)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tatsumi, Yuko Osawa, Koichi Abe, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: The 42nd International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
  • Place of Presentation: I-messae hall, Himeji, Japan
  • Year and Date: 2015-09-23
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein (2015)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tasumi, Koichi Abe, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: 4th International Conference on Bio-Sensing Technology
  • Place of Presentation: Sheraton Lisboa Hotel & Spa, Lisbon, Portugal
  • Year and Date: 2015-05-10
  • Int'l Joint Research