| Project/Area Number |
15J12476
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Orthopaedic surgery
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
林 円香 東京大学, 大学院薬学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2017-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2016)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2016: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2015: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | IR/MAR法 / scFv三量体 / バイファンクショナル / 骨粗鬆症治療薬 / IgG2 / RANKL逆シグナル / 全長ヒトIgG2 / 親和性成熟 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度取得した、in vitroでバイファンクショナルな活性を示す全長抗体IgG2安定的に高発現する細胞株を取得するため、IR-MAR法を用い、目的のプラスミドをCHO-DG44細胞に導入し、薬剤選抜を行うことで、目的遺伝子を高発現する細胞クローンを単離濃縮した。この細胞を一定期間培養した後、培地を回収し、proteinAビーズ、およびRANKL細胞外ドメインの組換タンパク質をカップリングさせたCNBrビーズを用いて精製し、抗体の組換タンパク質を取得した。
また、同様の活性を示すscFv三量体を用い、in vivoの検証を進めた。前年度のin vitroの検証により見出した、「RANKL逆シグナルは、骨芽細胞の分化前期を促進する一方、分化後期を抑制する」という知見に基づくと、生体での持続的なRANKL逆シグナル入力は、分化途上の未熟な骨芽細胞を蓄積させる一方、骨形成を担う分化後期の骨芽細胞の増加を抑制すると考えられる。そのため、RANKL逆シグナルを間欠的に入力することにより、シグナル入力期間中は初期の骨芽細胞が増加し、シグナルを解除すると、これらの骨芽細胞が成熟骨芽細胞、骨細胞にまで分化する可能性が推定された。そこで、野生型マウスにscFv三量体を5日間連続で腹腔内投与し、経時的に採血して骨代謝を反映する血清マーカーの変動を測定した。その結果、骨吸収マーカーであるTRAP5bが低下すると同時に、骨形成に関しては、初期骨芽細胞マーカーであるⅠ型コラーゲン-N-プロペプチド (P1NP) が上昇した一方、後期骨芽細胞マーカーであるGla化Osteocalcinは低下した。また、投与を停止し、RANKL逆シグナルの影響が解除されると、蓄積した初期の骨芽細胞の後期分化段階への移行が進み、Gla化Osteocalcinは上昇を示した。
以上の結果をまとめ、論文投稿準備中である。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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