新規光機能性分子によるタンパク質機能の制御

• Project/Area Number: 15J30005
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Bio-related chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 宇野 真之介 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2017: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2016: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2015: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: タンパク質タグ / フォトクロミック分子 / アゾベンゼン / シアニン / タンパク質タグ、

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、昨年度に引き続きタンパク質の機能を制御し得る光機能性分子の開発を進めた。具体的には（１）光照射により結合・解離を制御できるタンパク質タグ及び（２）光照射に応じて分子の電荷状態を変化させる分子の合成と物性の評価に注力した。
（１）に関しては昨年度合成したAzoTMPのeDHFRとの結合・解離を生細胞中で評価した。まず蛍光色素SiRと結合した、AzoTMP-SiR及びTMP-SiRをそれぞれ合成した。次に細胞の内膜に局在するCAAXタンパク質モチーフとeDHFRをHEK細胞に共発現した。この細胞にリガンドを添加し、洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。AzoTMP-SiRは細胞膜を透過し、細胞の内膜に局在する様子が観察できた。次に、紫外光の照射により内膜から解離し、細胞質に拡散していく様子が観測できるかを試した。紫外光を照射した結果、膜状の蛍光強度の減少が見られたが、TMP-SiRと優位な差は見られなかった。これは、解離定数の変化が不十分であるといったことが原因と考えられ、タグタンパク質の改変や基質分子への嵩高い置換基の導入などにより、より大きい解離定数の変化を示すペアの開発が必要である。（２）においては、シアニン類に分子内求核基を導入し、温和な条件下で光応答性を示す分子の開発を試みた。Cy5又はクマリン－シアニンハイブリッド（CC）を骨格として選択し、分子内求核基を導入した分子を設計、合成した。まずpHによる影響を確認した結果、Cy5誘導体では吸光度が一定であるのに対して、CC誘導体では中性～弱塩基性で吸光度が低下する現象が確認された。さらに、インドール環部位にカルボン酸、アミノ基、アミド基等を導入することでこれらのｐH応答性が大きく変化することを明らかにした。これらの結果よりCC誘導体がペプチダーゼ等を検出する蛍光プローブの新規母核として有用であることが示唆された。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] スイス連邦工科大学ローザンヌ校 (EPFL)(スイス)
• [Int'l Joint Research] EPFL(Switzerland)
• [Journal Article] A green-light-emitting, spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for dual-colour super-resolution imaging (2018)
  • Author(s): Shin-nosuke Uno、Mako Kamiya、Akihiko Morozumia、Yasuteru Urano
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 54 Issue: 1 Pages: 102-105
  • DOI: 10.1039/c7cc07783a
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A guide to use photocontrollable fluorescent proteins and synthetic smart fluorophores for nanoscopy (2015)
  • Author(s): Uno SN, Tiwari DK, Kamiya M, Arai Y, Nagai T, Urano Y.
  • Journal Title: Microscopy Volume: 64 Issue: 4 Pages: 263-277
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfv037
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging (2017)
  • Author(s): Shin-nosuke Uno, Mako Kamiya, Toshitada Yoshihara, Ko Sugawara, Kohki Okabe, Takashi Funatsu, Yasushi Okada, Seiji Tobita, Yasuteru Urano
  • Organizer: International Symposium on Imaging Frontier 2017 (ISIF 2017)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 自発的に明滅する蛍光色素の開発とライブセル超解像蛍光イメージングへの応用 (2016)
  • Author(s): 宇野真之介、神谷真子、吉原利忠、菅原皓、岡部弘基、Mehmet C. Tarhan、 藤田博之、船津高志、岡田康志、飛田成史、浦野泰照
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-01
  • Invited
• [Presentation] A spontaneously blinking fluorophore based on intramolecular spirocyclization for live-cell super-resolution imaging (2015)
  • Author(s): Shinnosuke Uno
  • Organizer: 2015 Reaxys PhD Prize Symposium
  • Place of Presentation: Hyatt Regency Hong Kong Sha Tin (Sha Tin, Hong Kong)
  • Year and Date: 2015-09-08
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 分子内スピロ環化平衡に基づく超解像蛍光イメージングプローブの創製 (2015)
  • Author(s): 宇野 真之介
  • Organizer: 育志賞研究発表会
  • Place of Presentation: 京都大学百周年時計台記念館 （京都府、京都市）
  • Year and Date: 2015-08-31
• [Presentation] 自発的に明滅する蛍光プローブの開発とライブセル超解像蛍光イメージングへの応用 (2015)
  • Author(s): 宇野真之介、神谷真子、吉原利忠、菅原皓、岡部弘基、Mehmet C. Tarhan、 藤田博之、船津高志、岡田康志、飛田成史、浦野泰照
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会 第10回年会
  • Place of Presentation: 東北大学 川内キャンパス 東北大学百周年記念会館 川内萩ホール （宮城県、仙台市）
  • Year and Date: 2015-06-12
• [Patent(Industrial Property Rights)] 超解像蛍光イメージング用プローブ (2016)
  • Inventor(s): 浦野泰照、神谷真子、両角明彦、宇野真之介、梅澤啓太郎
  • Industrial Property Rights Holder: 浦野泰照、神谷真子、両角明彦、宇野真之介、梅澤啓太郎
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2016-02-23