ミトコンドリア内への過剰なＣａ２＋流入を感知・抑制する蛋白質複合体の構造生物学

• Project/Area Number: 15J40096
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: The University of Tokushima
• Research Fellow: 真板 綾子 徳島大学, 医歯薬学研究部, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2015-07-29 – 2019-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2018: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2017: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2015: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
• Keywords: 蛋白質複合体 / X線結晶構造解析 / ミトコンドリア / カルシウム

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリアへの過剰なCa2+取り込みの制御に関わるHAX-1-UCP3複合体に着目し、この複合体の構造機能相関研究を行った。これまでに、HAX-1とUCP3の相互作用領域がそれぞれC末端側領域HAX-1(211-280)とミトコンドリア内腔に存在するループ2領域(UCP3(165-175))であること及び両者の結合にはCa2+の存在が必須であること明らかにした。また、HAX-1(211-280)に関しては、Ca2+と直接結合すること及びその結合により大きな構造変化が誘起されることから、HAX-1(211-280)のCa2+結合を介した大きな立体構造変化がミトコンドリア内のCa2+濃度上昇の感知とUCP3との結合に関与している可能性を示唆した。前年度までに、HAX-1のカルシウム結合・膜結合に関わる残基の一部を同定することにより、カルシウムとの結合により膜結合性を獲得するという興味深い知見を得た。そこで、今年度は、膜と結合するHAX-1のC末端のαへリックス領域を取り除いたHAX-1(211-247)/(211-266)の発現系・大量精製系を構築し、その試料を用いてNMR法による相互作用解析及びＸ線回折実験に用いるための共結晶化を行った。NMR法では、HAX-1(211-247)/(211-266)はUCP3ループ2ペプチドと結合可能であること及びCa2+と結合しないことを明らかにした。これより、Ca2+非存在下では、アンフォールド状態のC末端側のαヘリックス領域が、HAX-1のUCP3結合領域をマスクしている可能性が考えられた。一方、HAX-1(211-247)/HAX-1(211-266)の大量調製を行い、UCP3ループ2ペプチドとHAX-1(211-247)/(211-266)の共結晶化スクリーニングを行ったが、回折実験に供する結晶は得られなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、HAX-1-UCP3複合体形成機構の解明を目指し、NMR法による相互作用解析及び共結晶化を精力的に行っている。前年度までに、HAX-1のカルシウム結合・膜結合に関わる残基の一部を同定し、カルシウムとの結合により膜結合性を獲得するという興味深い知見も得ている。今年度は、構造解析を困難にしているHAX-1の膜結合に関わるαヘリックスを除去したコンストラクトを二種類作成し、NMR法によるカルシウム結合、UCP3のループ2ペプチドとの相互作用解析を行った。興味深いことに、C末端側の膜結合ヘリックスを取り除いた領域では、UCP3ループ2ペプチドとの結合は保持するが、カルシウムと直接結合しないことを明らかにしている。したがって、カルシウム結合にはC末端側のヘリックス領域の残基が必要であることと、UCP3結合表面はカルシウム結合とは依存しないことがわかった。当初の結晶構造解析で複合体構造を明らかにする方向とは違う方向に進んでいるが、随所で興味ある成果が得られていることから、「おおむね順調に進展している」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までに、HAX-1の膜結合に関わるαヘリックスを除去したHAX-1(211-247)及びHAX-1(211-266)のNMRを用いたUCP3ループ2ペプチドとの相互作用解析の結果より、HAX-1のUCP3ループ2ペプチド結合に関わる残基はアミノ酸残基211-247の間にあり、その結合はカルシウムの有無に依存しないことを明らかにした。今後は、HAX-1(211-247)の13C/15N二重標識試料の調製し、三重共鳴法によるNMR測定を行い、主鎖の帰属を行う。この帰属の結果と、昨年度行った相互作用解析の結果から、UCP3ペプチド2との結合に直接関与するHAX-1の残基の同定を行う。一方、HAX-1のカルシウム結合に関しては、当初、HAX-1(211-247)の領域内にある酸性残基のみがカルシウムとの結合に関与していると考えていたが、上記のコンストラクトを用いたカルシウムとの相互作用解析より、カルシウム結合にはC末端側の領域の残基も関与することが明らかになった。そこで、今後は、カルシウム結合に関与しているC末端側の残基を変異体実験により明らかにする。以上のことより、UCP3とHAX-1の相互作用様式及びカルシウムの役割を明確にする。

Research Products

• [Journal Article] Reactive oxygen species up-regulate expression of muscle atrophy-associated ubiquitin ligase Cbl-b in rat L6 skeletal muscle cells. (2018)
  • Author(s): Uchida, T., Sakashita, Y., Kitahata, K., Yamashita, Y., Tomida, C., Kimori, Y., Komatsu, A., Hirasaka, K., Ohno, A., Nakao, R., Higashitani, A., Higashibata, A., Ishioka, N., Shimazu, T., Kobayashi, T., Okumura, Y., Choi, I., Oarada, M., Mills, E. M., Teshima-Kondo, S., Takeda, S., Tanaka, E., Tanaka, K., Sokabe, M., and Nikawa, T.
  • Journal Title: Am J Physiol Cell Physiol. Volume: 印刷中
  • DOI: 10.1152/ajpcell.00184.2017
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 無重力の筋タンパク質代謝に及ぼす影響とその栄養学的制御法 (2018)
  • Author(s): 二川 健・内田 貴之・真板 綾子・中尾 玲子・寺尾 純二
  • Journal Title: 生体の科学 Volume: 69 Pages: 118-122
• [Journal Article] VEGF pathway-targeting drugs induce evasive adaptation by activation of neuropilin-1/cMet in colon cancer cells (2018)
  • Author(s): Tomida Chisato、Yamagishi Naoko、Nagano Hikaru、Uchida Takayuki、Ohno Ayako、Hirasaka Katsuya、Nikawa Takeshi、Teshima-Kondo Shigetada
  • Journal Title: Int. J. Oncol. Volume: 52 Pages: 1350-1362
  • DOI: 10.3892/ijo.2018.4291
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Antiangiogenic agent sunitinib induces epithelial to mesenchymal transition and accelerates motility of colorectal cancer cells (2017)
  • Author(s): Chisato Tomida, Naoko Yamagishi, Hikaru Nagano, Takayuki Uchida, Ayako Ohno, Katsuya Hirasaka, Takeshi Nikawa, Shigetada Teshima-Kondo
  • Journal Title: THE JOUNAL OF MEDICAL INVESTIGATION Volume: 64 Issue: 3.4 Pages: 250-254
  • DOI: 10.2152/jmi.64.250
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Regorafenib induces adaptive resistance of colorectal cancer cells via inhibition of vascular endothelial growth factor receptor (2017)
  • Author(s): Tomida Chisato、Nagano Hikaru、Yamagishi Naoko、Uchida Takayuki、Ohno Ayako、Hirasaka Katsuya、Nikawa Takeshi、Teshima-Kondo Shigetada
  • Journal Title: THE JOUNAL OF MEDICAL INVESTIGATION Volume: 64 Issue: 3.4 Pages: 262-265
  • DOI: 10.2152/jmi.64.262
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Capric Acid Up-Regulates UCP3 Expression without PDK4 Induction in Mouse C2C12 Myotubes. (2016)
  • Author(s): Abe T, Hirasaka K, Kohno S, Tomida C, Haruna M, Uchida T, Ohno(Maita) A, Oarada M, Teshima-Kondo S, Okumura Y, Choi I, Aoyama T, Terao J, Nikawa T.
  • Journal Title: J Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo). Volume: 62 Pages: 32-39
• [Journal Article] Structural analysis of the TKB domain of ubiquitin ligase Cbl-b complexed with its small inhibitory peptide, Cblin. (2016)
  • Author(s): Ohno A. Ochi A., Maita N., Ueji. T., Bando A., Nakao R., Hirasaka K., Abe T., Teshima-Kondo S., Nemoto H., Okumura Y., Higashibata A., Yano S., Tochio H., Nikawa T
  • Journal Title: Arch. Biochem. Biophys Volume: 594 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1016/j.abb.2016.02.014
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] UCP3 is associated with Hax-1 in mitochondria in the presence of calcium ion. (2016)
  • Author(s): Hirasaka K., Mills E. M., Haruna M., Bando A., Ikeda C., Abe T., Kohno S., Nowinski S. M., Lago C. U., Akagi K., Tochio H., Ohno A., Teshima-Kondo S., Okumura Y., Nikawa T.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 472 Pages: 108-113
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.02.075
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 高病原性インフルエンザ感染に関わる宿主酵素MSPLと阻害ペプチドとの複合体構造 (2017)
  • Author(s): 真板 綾子
  • Organizer: 第71回日本栄養・食糧学会
• [Presentation] Ⅱ型膜貫通型セリンプロテアーゼMSPLとペプチド性阻害剤との複合体結晶構造解析 (2016)
  • Author(s): 真板綾子、真板宣夫、奥村裕司、 永野ひかる、次田早希、有田恭平、田畑孝統、平坂勝也、安倍知紀、近藤茂忠、二川健
  • Organizer: 第39回 分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜 （神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-02
• [Presentation] Calcium-Dependent Interaction between UCP3 and HAX-1 (2016)
  • Author(s): Ohno(Maita) A., Tsugita S., Hirasaka K., Haruna M., Ikeda C., Akagi K., Tochio H., Kondo S., Okumura Y., Nikawa T
  • Organizer: XXIIth ICMRBS
  • Place of Presentation: Kyoto International Coference Center (京都府京都市）
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 廃用性筋萎縮原因酵素Cbl-bと阻害ペプチドCblinとの複合体結晶構造解析 (2016)
  • Author(s): 真板綾子、真板宣夫、次田早希、安倍知紀、平坂勝也、奥村裕司、 近藤茂忠、二川健
  • Organizer: 病態プロテアーゼ学会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター （大阪府豊中市）
  • Year and Date: 2016-08-05
• [Presentation] 高病原性インフルエンザウィルス感染に関わる宿主酵素MSPLとペプチド性阻害剤の複合体結晶構造 (2016)
  • Author(s): 真板綾子、真板宣夫、奥村裕司、永野ひかる、次田早希、有田恭平、坂東亜紀、田畑考統、平坂勝也 、安倍知紀 、 近藤茂忠、二川健
  • Organizer: 第16回蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場 （福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-09
• [Presentation] UCP3とHax-1の相互作用様式の解明 (2016)
  • Author(s): 次田早希、真板綾子、平坂勝也、赤木謙一、杤尾 豪人、安倍知紀、近藤茂忠 、奥村裕司、二川 健
  • Organizer: 第16回蛋白質科学会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場 （福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] HAX-1とUCP3の相互作用様式の解明 (2015)
  • Author(s): 次田早希 、真板綾子 、平坂勝也 、坂下禎宏 、井田くるみ 、春名真里江 、Floriane Rudwill 、安倍知紀 、近藤茂忠 、奥村裕司 、二川 健
  • Organizer: 第48回 日本栄養・食糧学会 中国・四国支部大会
  • Place of Presentation: 広島女学院大学（広島県・広島市）
  • Year and Date: 2015-11-01
• [Presentation] 「UCP3とHAX-1の相互作用様式の解明」 (2015)
  • Author(s): 次田早希 、平坂勝也 、奥村裕司 、安倍知紀 、真板綾子 、近藤茂忠 、二川 健
  • Organizer: 第20回 日本病態プロテアーゼ学会学術集会
  • Place of Presentation: ANAクラウンプラザホテルグランコート名古屋(愛知県・名古屋市）
  • Year and Date: 2015-08-22