ミクロセル融合を介して染色体ベクターを効率よく受容細胞に移入する技術の確立

• Project/Area Number: 15K01291
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Biomedical engineering/Biomaterial science and engineering
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 加藤 基伸 鳥取大学, 医学部, 研究員 (00273904)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 敏昭 鳥取大学, 医学部, 准教授 (80305573)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2017: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2016: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2015: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 染色体ベクター / ミクロセル / 細胞融合

Outline of Annual Research Achievements

一般的な遺伝子導入に用いるベクターサイズは、プラスミドであれば10kb以下であり、宿主大腸菌から抽出したDNAをトランスフェクション法によって受容細胞に導入することができる。これに対し染色体ベクターは、動物細胞を「宿主」としサイズはMbオーダーに及ぶため、染色体ベクターのみをインタクトなDNAとして単離することはできない。このため染色体ベクターを供与細胞から受容細胞に移すには、染色体ベクターの担体としてのミクロセルを利用する。供与細胞にコルセミドを投与するとチューブリンタンパク質の重合が阻害され、染色体分配と細胞質分裂を伴わず細胞周期が進行し、核膜再構築が起きて多数の微小核が形成される。さらに供与細胞にアクチンタンパク質の重合阻害剤であるサイトカラシンを投与し遠心力をかけると、細胞膜の破断と修復が生じ、細胞内容を包摂するミクロセルが形成される。現状ではヘテロな集団であるミクロセルと受容細胞との融合により目的細胞が得られる率は、受容細胞あたり「10の6乗分の1」程度である。染色体ベクターを含むミクロセル画分のみを選択的に分取できれば染色体ベクターの移入効率は飛躍的に増加することが見込まれる。初年度には、蛍光融合タンパク質による染色体ベクター標識の妥当性について検討した。
染色体ベクター標識のための蛍光融合ヒストンH2Bタンパク質発現ベクターを構築し、Cre/loxPシステムを利用した部位特異的組換え挿入反応を利用して、供与細胞であるCHO細胞内にて人工染色体ベクター上に挿入した。蛍光融合ヒストンH2Bタンパク質の発現、
細胞核への局在が確認でき、コルセミド投与による微小核形成過程の経時変化が追跡可能となった。

Research Products

• [Journal Article] A pathway from chromosome transfer to engineering resulting in human and mouse artificial chromosomes for a variety of applications to bio-medical challenges. (2015)
  • Author(s): Oshimura Mitsuo, Uno Narumi, Kazuki Yasuhiro, Katoh Motonobu, Inoue Toshiaki
  • Journal Title: Chromosome Res. Volume: 23 Issue: 1 Pages: 111-133
  • DOI: 10.1007/s10577-014-9459-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Retargeting of microcell fusion towards recipient cell-oriented transfer of human artificial chromosome (2015)
  • Author(s): Hiratsuka M, Ueda K, Uno N, Uno K, Fukuhara S, Kurosaki H, Takehara S, Osaki M, Kazuki Y, Kurosawa Y, Nakamura T, Katoh M, Oshimura M
  • Journal Title: BMC Biotechnol. Volume: 15 Issue: 1 Pages: 58-58
  • DOI: 10.1186/s12896-015-0142-z
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Construction of a Luciferase Reporter System to Monitor Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells by Using a Mammalian Artificial Chromosome Vector. (2015)
  • Author(s): Narai T, Katoh M, Inoue T, Taniguchi M, Kazuki K, Kazuki Y, Sato K, Kodani I, Ryoke K, Oshimura M.
  • Journal Title: Yonago Acta Med Volume: 58 Pages: 23-29
  • NAID: 120005596729
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ミクロセル融合を介した染色体ベクター移入法の改良 (2015)
  • Author(s): 山本加奈恵、楠瀬未菜、中山祐二、井上敏明、押村光雄、加藤基伸
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会 年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01