神経筋接合部における増殖因子の役割

• Project/Area Number: 15K06707
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Neurophysiology / General neuroscience
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 大河原 美静 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (80589606)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2017: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2016: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2015: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 神経筋接合部 / 増殖因子 / シグナル伝達経路

Outline of Annual Research Achievements

神経筋接合部（NMJ）は運動神経と筋肉細胞を結ぶシナプスで、その形態形成は運動神経が分泌するagrinの受容体であるLRP4/MuSKとその下流のシグナル伝達経路が重要であることが知られている。本研究はNMJとagrin/LRP4/MuSKに対する分泌型増殖因子の機能を知る事を目標にし、増殖因子またはそれにより活性化されるシグナル伝達経路がNMJの形態形成にどのようにかかわるのかを検討している。昨年までにヒト胎児腎細胞HEK293にagrin、LRP4、MuSKを発現させると活性化されるATF2-Lucレポーターを指標に、候補となる７つの分泌型増殖因子BMP、IGF、TGFbeta、TNF、hedgehog、VEGF、notchがagrin/LRP4/MuSKシグナルにどのように影響しているかを検討していた。その結果TNF、VEGF、notchについてはこの因子の下流のシグナルを化合物で阻害しても、レポーターの活性化度合いに変化はなかったことを報告した。そこで、それ以外の増殖因子（BMP、IGF、TGFbeta、hedgehog）の下流のシグナルを化合物で阻害し、筋肉細胞においてAgrinが誘導するアセチルコリン受容体の集積の状態を観察した。その結果、IGFとhedgehogに関しては一定の結果が得られなかった。これは、Agrinが誘導するアセチルコリン受容体への作用より前に、この二つの因子が筋肉の分化に関わる可能性を示唆している。そのため、作用時間を短くするなどの工夫が必要であると考えられた。一方、BMPまたはTGFbetaのシグナルが阻害剤によって抑制されるとagrinが誘導するアセチルコリン受容体の集積が抑制されることがわかった。shRNAによる阻害実験を検討していたが、発現を抑制するウィルスベクターの探索が遅れ、それを使った実験が間に合わなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度の目標であった「興味深いシグナル伝達経路が存在した場合には、ステップ３として各シグナル伝達経路を構成する個々の因子のNMJ形成における機能解析を行う。」現在候補として残っているシグナル伝達経路に関わる因子のいくつかに対するshRNAによる阻害実験を検討し、その配列の設計を行った。しかし、適切な配列の選択作業が遅れたため、期限内までに最終目標にまでは達しなかったものの順調に進展している。
最終目的に対する相対的な達成度合いは「やや遅れている」と考える。

Strategy for Future Research Activity

提出された研究計画に基づき、最終的に「NMJにおける増殖因子の機能を知り神経シナプス形成に対する増殖因子の生理的な役割を知るための基盤となる知識を得る」ことをめざし、shRNAの機能阻害実験をすすめる。また抑制薬剤などを用いた機能阻害実験についても、実験を重ねることで確認作業を行う。リン酸化抗体を用いたウェスタンブロットや標的タンパクの発現量の確認など、比較的結果がわかりやすい実験方法を用いて各増殖因子の役割の有無を比較・検討をしていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Lack of Fgf18 causes abnormal clustering of motor nerve terminals at the neuromuscular junction with reduced acetylcholine receptor clusters (2018)
  • Author(s): Ito Kenyu、Ohkawara Bisei、Yagi Hideki、Nakashima Hiroaki、Tsushima Mikito、Ota Kyotaro、Konishi Hiroyuki、Masuda Akio、Imagama Shiro、Kiyama Hiroshi、Ishiguro Naoki、Ohno Kinji
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 8 Pages: 434-434
  • DOI: 10.1038/s41598-017-18753-5
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fluoxetine ameliorates cartilage degradation in osteoarthritis by inhibiting Wnt/β-catenin signaling (2017)
  • Author(s): Miyamoto Kentaro、Ohkawara Bisei、Ito Mikako、Masuda Akio、Hirakawa Akihiro、Sakai Tadahiro、Hiraiwa Hideki、Hamada Takashi、Ishiguro Naoki、Ohno Kinji
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0184388
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] SRSF1 suppresses selection of intron-distal 5' splice site of DOK7 intron 4 to generate functional full-length Dok-7 protein (2017)
  • Author(s): Ahsan Khalid Bin、Masuda Akio、Rahman Mohammad Alinoor、Takeda Jun-ichi、Nazim Mohammad、Ohkawara Bisei、Ito Mikako、Ohno Kinji
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Pages: 10446-10446
  • DOI: 10.1038/s41598-017-11036-z
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Agrin-LRP4-MuSK signaling as a therapeutic target for myasthenia gravis and other neuromuscular disorders (2017)
  • Author(s): Ohno Kinji、Ohkawara Bisei、Ito Mikako
  • Journal Title: Expert Opinion on Therapeutic Targets Volume: 21 Pages: 949-958
  • DOI: 10.1080/14728222.2017.1369960
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesi (2017)
  • Author(s): Osawa Yusuke、Matsushita Masaki、Hasegawa Sachi、Esaki Ryusaku、Fujio Masahito、Ohkawara Bisei、Ishiguro Naoki、Ohno Kinji、Kitoh Hiroshi
  • Journal Title: Bone. Volume: 105 Pages: 42-49
  • DOI: 10.1016/j.bone.2017.05.016
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Wnt/β-catenin signaling suppresses expressions of Scx, Mkx, and Tnmd in tendon-derived cells (2017)
  • Author(s): Kishimoto Yasuzumi、Ohkawara Bisei、Sakai Tadahiro、Ito Mikako、Masuda Akio、Ishiguro Naoki、Shukunami Chisa、Docheva Denitsa、Ohno Kinji
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0182051
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Competitive regulation of alternative splicing and alternative polyadenylation by hnRNP H and CstF64 determines acetylcholinesterase isoforms. (2017)
  • Author(s): Nazim M, Masuda A, Rahman MA, Nasrin F, Takeda JI, Ohe K, Ohkawara B, Ito M, Ohno K.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: - Pages: 1455-1455
  • DOI: 10.1093/nar/gkw823
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Molecular hydrogen suppresses activated Wnt/beta-catenin signaling (2017)
  • Author(s): Lin Y, Ohkawara B, Ito M, Misawa N, Miyamoto K, Takegami Y, Masuda A, Toyokuni S, Ohno K.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6 Pages: 31986-31986
  • DOI: 10.1038/srep31986
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] R-spondin 2 promotes acetylcholine receptor clustering at the neuromuscular (2016)
  • Author(s): Nakashima H., Ohkawara B., Ishigaki S., Fukudome T., Ito K., Tsushima M., Konishi H., Okuno T., Yoshimura T., Ito M., Masuda A., Sobue G., Kiyama H., Ishiguro N., Ohno K.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 22 Pages: 28512-28512
  • DOI: 10.1038/srep28512
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Phenylbutazone induces expression of MBNL1 and suppresses formation of MBNL1-CUG RNA foci in a mouse model of myotonic dystrophy. (2016)
  • Author(s): 1.Chen G, Masuda A, Konishi H, Ohkawara B, Ito M, Kinoshita M, Kiyama H, Matsuura T, Ohno K.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1038/srep25317
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] R-spondin 2 facilitates differentiation of proliferating chondrocytes into hypertrophic chondrocytes by enhancing Wnt/beta-catenin signaling in endochondral ossification (2016)
  • Author(s): Takegami Y, Ohkawara B, Ito M, Masuda A, Nakashima H, Ishiguro N, Ohno K.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: S0006-291X(16) Pages: 255-264
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.03.089
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Zonisamide Enhances Neurite Elongation of Primary Motor Neurons and Facilitates Peripheral Nerve Regeneration In Vitro and in a Mouse Model. (2015)
  • Author(s): Yagi H, Ohkawara B, Nakashima H, Ito K, Tsushima M, Ishii H, Noto K, Ohta K, Masuda A, Imagama S, Ishiguro N, Ohno K.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 10(11)
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0142786
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Collagen Q and anti-MuSK autoantibody competitively suppress agrin/LRP4/MuSK signaling (2015)
  • Author(s): Otsuka K, Ito M, Ohkawara B, Masuda A, Kawakami Y, Sahashi K, Nishida H, Mabuchi N, Takano A, Engel AG, Ohno K.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 5 Pages: 13928-13928
  • DOI: 10.1038/srep13928
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Impaired Synaptic Development, Maintenance, and Neuromuscular Transmission in LRP4-Related Myasthenia (2015)
  • Author(s): Selcen D, Ohkawara B, Shen XM, McEvoy K, Ohno K, Engel AG.
  • Journal Title: JAMA Neurol Volume: 72(8) Pages: 889-896
  • DOI: 10.1001/jamaneurol.2015.0853
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A missense mutation in domain III in HSPG2 in Schwartz-Jampel syndrome compromises secretion of perlecan into the extracellular space (2015)
  • Author(s): Iwata S, Ito M, Nakata T, Noguchi Y, Okuno T, Ohkawara B, Masuda A, Goto T, Adachi M, Osaka H, Nonaka R, Arikawa-Hirasawa E, Ohno K.
  • Journal Title: Neuromuscul Disord Volume: 25(8) Pages: 667671-667671
  • DOI: 10.1016/j.nmd.2015.05.002
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Position-specific binding of FUS to nascent RNA regulates mRNA length (2015)
  • Author(s): Masuda A, Takeda J, Okuno T, Okamoto T, Ohkawara B, Ito M, Ishigaki S, Sobue G, Ohno K.
  • Journal Title: Genes Dev Volume: 29(10) Pages: 10451057-10451057
  • DOI: 10.1101/gad.255737.114
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Wnt-related molecules at mammalian neuromuscular junction (2017)
  • Author(s): Bisei Ohkawara
  • Organizer: Wnt Gordon Research Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 経筋接合部の構成因子としてのCTGFの役割 (2016)
  • Author(s): 大河原美静、大野欽司
  • Organizer: ＣＣＮファミリー研究会
  • Place of Presentation: 岡山大学鹿田キャンパス内(岡山県岡山市)
• [Patent(Industrial Property Rights)] 末梢神経障害治療薬 (2015)
  • Inventor(s): 大野 欽司、石黒 直樹、大河原 美静、八木 秀樹
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学、大日本住友製薬
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2015-193291
  • Filing Date: 2015-09-30
  • Application Year: 2015