ガン特異的TCR遺伝子を簡便・迅速に取得するシステムの構築

• Project/Area Number: 15K06872
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Tumor therapeutics
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 浜名 洋 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (90551549)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村口 篤 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (20174287)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2017: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2016: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2015: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: TCR遺伝子増幅 / 単一細胞RT-PCR / 腫瘍浸潤リンパ球 / がん特異的TCR / メラノーマ / B16F10 / ルシフェラーゼアッセイ / T細胞受容体(TCR) / レポーターアッセイ

Outline of Annual Research Achievements

TCR遺伝子治療においては、いかにして個々の患者から迅速にガン特異的TCR遺伝子を取得するかが重要な課題の1つである。本研究では「ガン特異的TCR遺伝子を簡便・迅速に取得するシステムの構築」を目的として研究を行った。

初年度は、単一T細胞からTCR cDNAを効率よく簡便に増幅するために、One-step multiplex RT-PCRを用いた方法を確立した。これにより、ヒトおよびマウスの単一T細胞から、80%以上の効率でTCRαβ cDNAの増幅が可能となった。また、TCRの機能を迅速に解析するために遺伝子改変細胞(293T-Luc)を作製した。この細胞を用いたルシフェラーゼ・レポーターアッセイにより、最短4日でTCRの抗原特異性を評価することが可能となった。また、C57BL/6マウスのB16F10メラノーマ腫瘍浸潤T細胞(TIL)を取得し、それらから我々のPCR法により迅速・簡便にTCR cDNAの増幅が可能であることを確認した。

次年度は、5匹の担癌マウスから取得したCD8+CD137+ TIL由来TCR遺伝子(13種類)をレトロウイルスベクターを用いてマウス脾臓由来のT細胞に遺伝子導入した。そして、そのT細胞とB16F10を共培養し細胞傷害活性を検討した。その結果、9種類のTCR遺伝子導入T細胞においてB16F10に対する細胞障害活性が認められらた。次に、ルシフェラーゼを恒常的に発現するB16F10細胞株B16F10-Lucを作成し、この細胞を用いてマウスの肺転移モデルによりTCRの細胞傷害活性能を評価した。in vitroで細胞障害活性の高かった2種類のTCR遺伝子導入細胞T細胞を用いてB16F10-Lucの肺転移を、5匹のマウスで解析した。その結果、2種類のTCR遺伝子導入細胞T細胞はコントロールに比べ優位にB16F10-Lucの肺転移を抑制することが示された。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Manitoba/McGill University(カナダ)
• [Int'l Joint Research] Third Military Medical University/Sichuan University(中国)
• [Int'l Joint Research] Pasteur Institute of Tunis(チュニジア)
• [Int'l Joint Research] University of Iowa(米国)
• [Int'l Joint Research] Pasteur Institute of Iran(イラン)
• [Journal Article] A novel, rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells. (2016)
  • Author(s): Hamana H, Shitaoka K, Kishi H, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 474 Pages: 709-714
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Identification of broadly conserved cross-species protective Leishmania antigen and its responding CD4 + T cells (2015)
  • Author(s): Z. Mou, J. Li, T. Boussoffara, H. Kishi, H. Hamana, P. Ezzati, C. Hu, W. Yi, D. Liu, F. Khadem, I. Okwor, P. Jia, K. Shitaoka, S. Wang, M. Ndao, C. Petersen, J. Chen, S. Rafati, H. Louzir, A. Muraguchi, J. a Wilkins, and J. E. Uzonna,
  • Journal Title: Science Translational Medicine Volume: 7 Issue: 310 Pages: 1-13
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.aac5477
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] A rapid and easy system providing cDNAs cloning of antigen specific TCRs from single human and mouse T-cells within 4 days (2016)
  • Author(s): HAMANA Hiroshi, KISHI Hiroyuki, SHITAOKA Kiyomi, OZAWA Tatsuhiko, MURAGUCHI Atsushi
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター、ラグナガーデンホテル(宜野湾市)
  • Year and Date: 2016-12-05
• [Presentation] T cell receptor obtained from tumor-infiltrating lymphocytes without using tumor-specific antigens exhibits cytotoxicity to tumors in vitro and in vivo (2016)
  • Author(s): SHITAOKA Kiyomi, KISHI Hiroyuki, HAMANA Hiroshi, OZAWA Tatsuhiko, MURAGUCHI Atsushi
  • Organizer: 第45回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター、ラグナガーデンホテル(宜野湾市)
  • Year and Date: 2016-12-05
• [Presentation] A rapid and easy system for screening of antigen-specific TCRs (2016)
  • Author(s): HAMANA Hiroshi, KISHI Hiroyuki, SHITAOKA Kiyomi, Xiuhong Piao, OZAWA Tatsuhiko, MURAGUCHI Atsushi
  • Organizer: 16th International congress of immunology 2016
  • Place of Presentation: Melbourne Convention and Exhibition Centre(melbourne)
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] T cell receptor obtained from tumor-infiltrating lymphocytes without using tumor-specific antigens exhibits cytotoxicity to tumors in vitro and in vivo (2016)
  • Author(s): SHITAOKA Kiyomi, KISHI Hiroyuki, HAMANA Hiroshi, OZAWA Tatsuhiko, MURAGUCHI Atsushi
  • Organizer: 16th International congress of immunology 2016
  • Place of Presentation: Melbourne Convention and Exhibition Centre(melbourne)
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of an NFAT-luciferase reporter system for screening of antigen-specific TCRs using non-T cells (2015)
  • Author(s): HAMANA Hiroshi, KISHI Hiroyuki, SHITAOKA Kiyomi, Xiuhong Piao, OZAWA Tatsuhiko, MURAGUCHI Atsushi
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(札幌市)
  • Year and Date: 2015-11-18
• [Presentation] Identification of tumor-specific T cell receptors from primary tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) obtained from B16F10 melanoma-bearing mice (2015)
  • Author(s): SHITAOKA Kiyomi, KISHI Hiroyuki, HAMANA Hiroshi, OZAWA Tatsuhiko, MURAGUCHI Atsushi
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(札幌市)
  • Year and Date: 2015-11-18