外来DNAに対するホスト細胞のエピジェネティック制御機構の解明

• Project/Area Number: 15K06918
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: System genome science
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 菅谷 茂 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90334177)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2017: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2016: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2015: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
• Keywords: エピゲノム / 外来DNA / DNAメチル化 / エピソーム / DNA結合タンパク / 原子間力顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

ウィルス感染などにより誘導されるエピゲノム異常と疾患の関わりが示唆されており、分子機構の解明が希求されている。Epstein-Barrウイルスはホスト細胞感染時にエピソームを形成し、ウイルスゲノム自身もホストゲノムDNAもエピゲノム変化を生じる。
その分子機構を明らかにするため、エピソーマル型プラスミドをホスト細胞に導入し、エピソームに対するエピゲノム変化およびその原因候補タンパクの探索を行った。プラスミドは、oriP配列とEBNA1遺伝子、さらにGFP遺伝子と薬剤耐性遺伝子を導入した11kbのエピソーマル型プラスミドEB-Multi GFP（以下EBM）を用いた。GFPタンパクは、薬剤選択下では、高発現状態が維持されたが、薬剤非選択下では様々な発現レベルを示す集団が観察された。エピソームのDNAメチル化状態についてGFP遺伝子領域を含め、パイロシークエンス法を用いて解析し、メチル化の誘導を同定した。
次にEBNA1にFLAGタグを結合したFLAG-EBNA1タンパクを発現した293T細胞に、ビオチンラベルしたEBMプラスミドを導入し、エピソームに結合するタンパクの同定を行った。アビジンビーズによりEBM導入６日後の細胞からビオチンラベルDNAを回収し、これに結合するタンパクを抽出した。抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロティング解析により、抽出物中のFLAG-EBNA1タンパクをコントロールとして確認した。銀染色では複数のバンドを認め、LC-MS/MSによるEBM結合タンパクのプロテオミクス解析を行った。同定した候補タンパクのうちp53タンパクについては、ウエスタン法によりEBMプラスミドへの結合が確認された。さらに、shRNAによりp53発現を抑制した細胞では、EBMプラスミドのGFP発現の増大が観察され、p53がEBMプラスミドの発現制御に関与していることが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Extracellular Release of Annexin A2 is Enhanced upon Oxidative Stress Response via the p38 MAPK Pathway after Low-Dose X-Ray Radiation. (2016)
  • Author(s): Kita, K., Sugita, K., Sato, C., Sugaya, S. Sato T, Kaneda, A
  • Journal Title: Radiat. Res Volume: 186 Issue: 1 Pages: 79-91
  • DOI: 10.1667/rr14277.1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Extracellular Release of annexin A2 is enhanced upon oxidative stress response via the p38 MAPK pathway after low-dose X-ray radiation (2016)
  • Author(s): Kita K, Sugita K, Sato C, Sugaya S, Kaneda A
  • Journal Title: Radiat Res Volume: 185
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein kinase Cα-mediated cytotoxic activity of ineupatorolide B from Inula cappa DC. in HeLa cells (2015)
  • Author(s): Dong M, Hiwasa T, Cong B, Shi Q-W, Wang S-M, Kita K, Sugarya S, Suzuki N.
  • Journal Title: Int J Onco, Volume: 47 Issue: 5 Pages: 1839-1844
  • DOI: 10.3892/ijo.2015.3172
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] ホスト細胞のエピソーマル型外来DNAに対するエピゲノム異常誘導の解析 (2016)
  • Author(s): 菅谷茂、松坂恵介、船田さやか、福世真樹、佐藤守、松下一之、喜多和子、野村文夫、金田篤志
  • Organizer: 第３９回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
• [Presentation] エピソーマル型プラスミドベクターの長期培養後にみられるde novo DNAメチル化誘導の解析 (2015)
  • Author(s): 菅谷茂、松坂恵介、船田さやか、眞野恭伸、福世真樹、喜多和子、金田篤志
  • Organizer: 第88回日本生化学会大会（BMB２０１５）
  • Place of Presentation: 神戸国際展示場（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Remarks] 千葉大学大学院医学研究院分子腫瘍学HP
  • URL: http://www.m.chiba-u.ac.jp/class/moloncol/
• [Remarks] 分子腫瘍学教室ホームページ
  • URL: http://www.m.chiba-u.ac.jp/class/moloncol/