単一巨大リポソームによる開口放出様の膜融合の可視化解析

• Project/Area Number: 15K07033
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 田所 哲 帝京大学, 薬学部, 講師 (20389109)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2017: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2016: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2015: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: リポソーム / 開口放出 / 膜融合 / SNARE

Outline of Annual Research Achievements

マスト細胞には、炎症性メディエーターを含む分泌顆粒がある。細胞が抗原を感知すると、分泌顆粒が形質膜と融合して、内容物を細胞外に放出する（開口放出）。この開口放出の膜融合過程には、SNAREと呼ばれるタンパク質群が重要な役割を果たしている。我々は、形質膜上のSNAREタンパク質（SNAP-23/syntaxin-3）と分泌顆粒上のSNAREタンパク質（VAMP-8）を、それぞれ微小リポソームに組み込むことで、リポソーム間で膜融合が引き起こされることを明らかにした。本研究では、これらのSNAREタンパク質を巨大リポソームに組み込むことで、SNARE依存性の膜融合の可視化解析を行うことを目的とした。
無細胞タンパク質合成系を利用することで 、巨大リポソームにsyntaxin-3を外向きに組み込むことに成功した。しかしながら、SNAP-23とVAMP-8に関しては合成量が少なく条件を変えても改善がみられず、リポソームに組み込むまでには至らなかった。そこで無細胞タンパク質合成系を利用した方法ではなく、Yanagisawaらが報告した精製タンパク質を用いる方法で、巨大リポソームへの再構成を試みた。その結果、SNAP-23とsyntaxin-3が組み込まれた巨大リポソームと、VAMP-8が組み込まれた巨大リポソームを作製することに成功した。今後はリポソームに組み込まれたSNAREタンパク質の配向性を決定して、SNARE依存性の膜融合の可視化解析へと進める予定であったが、研究代表者が転職により科研費応募資格を喪失することになり、研究は中途で廃止申請を行った。

Research Products

• [Journal Article] Effect of Complexin II on Membrane Fusion between Liposomes Containing Mast Cell SNARE Proteins (2016)
  • Author(s): Satoshi Tadokoro, Naohide Hirashima, Naoko Utsunomiya-Tate
  • Journal Title: Biological and Pharmaceutical Bulletin Volume: 39 Issue: 3 Pages: 446-449
  • DOI: 10.1248/bpb.b15-00751
  • NAID: 130005132308
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Phosphorylation of syntaxin-3 at Thr 14 negatively regulates exocytosis in RBL-2H3 mast cells (2016)
  • Author(s): Satoshi Tadokoro, Tetsuhiro Shibata, Yoshikazu Inoh, Toshiro Amano, Mamoru Nakanishi, Naohide Hirashima, Naoko Utsunomiya-Tate
  • Journal Title: Cell Biology International Volume: 40 Issue: 5 Pages: 589
  • DOI: 10.1002/cbin.10600
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Effects of PIP2 on membrane fusion between mast cell SNARE liposomes mediated by synaptotagmin2 (2015)
  • Author(s): Satoshi Tadokoro, Yoshikazu Inoh, Mamoru Nakanishi, Naohide Hirashima
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta-Biomembranes Volume: 1848 Issue: 10 Pages: 2290-2294
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2015.06.016
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 正電荷リポソームによるマスト細胞活性化抑制機構の解明 (2017)
  • Author(s): 伊納義和
  • Organizer: 日本薬学会第１３７年会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター
  • Year and Date: 2017-03-25
• [Presentation] マスト細胞のSNARE依存性の膜融合におけるcomplexin IIの役割 (2016)
  • Author(s): 田所哲
  • Organizer: 第８９回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-09-27
• [Presentation] マスト細胞のSNARE依存性の膜融合におけるcomplexin IIのclamp効果 (2016)
  • Author(s): 田所哲、平嶋尚英、楯直子
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: 横浜
  • Year and Date: 2016-03-28
• [Presentation] マスト細胞におけるsyntaxin-3のリン酸化による開口放出制御機構 (2015)
  • Author(s): 田所哲、柴田哲大、天野稔朗、伊納義和、中西守、平嶋尚英、楯直子
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] 正電荷リポソームの物性がマスト細胞の脱顆粒反応抑制経路に及ぼす影響 (2015)
  • Author(s): 伊納義和、谷口奈央、田所哲、中西守、平嶋尚英、古野忠秀
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-02