インターフェロン誘導性酸化コレステロールによる炎症を制御する仕組み

Research Project

Project/Area Number	15K08537
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Research Field	Immunology
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	尼子豊公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医化学分野, 研究員 (00744822)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2016-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2015)
Budget Amount *help	¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000) Fiscal Year 2017: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2016: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2015: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	酸化コレステロール / I型インターフェロン / ISG / CH25h / 免疫 / ウイルス感染
Outline of Annual Research Achievements	当該年度は研究対象の主たる、I型インターフェロン誘導性のコレステロール酸化酵素であるCH25hのテトラサイクリン誘導性発現細胞の作成を行った。作成対象の細胞株としては、実際にCH25hのI型インターフェロンによる誘導性の確認されている肺と肝臓であることから、まず肝細胞を由来とするHuh7を用いた。テトラサイクリン誘導性発現系の基盤としてインビトロジェン社のT-REx, Flp-inシステムを採用した。ヒトのCH25hのcDNAをOrigene社から入手し（pCMV6-CH25h）これをpcDNA5/FRT/TOへ導入した。Huh7細胞はpFRT/LacZeoにより形質転換細胞をゼオシン薬剤耐性により選択した。得られた形質転換細胞はガラクトシダーゼ発現細胞を組織染色することでKnock-in alleleの転写活性を評価して、転写強度の強い細胞株を選択した。細胞はさらにテトラサイクリンリプレッサー発現細胞に形質転換された。この際にはpcDNA6/TRを改良し、テトラサイクリンリプレッサーとBlasticidin deaminaseを融合タンパクとして発現させることで転写誘導のキレを向上させた。この細胞を用いて最終的にはFlp-in法によりCH25h遺伝子をテトラサイクリン誘導性に発現するHuh7細胞を得ることができた。現在はこの細胞株を用いてCH25hの産物25-Hydroxycholesterolの輸送系についてそのメカニズムの詳細を検討中である。またCH25h遺伝子のノックアウト細胞の作成に向けたベクターシステムの構築を行った。