蛍光タンパク質プローブを用いた高尿酸血症治療薬スクリーニング法の開発

• Project/Area Number: 15K18847
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Field: Physical pharmacy
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• Principal Investigator: 中村 真希子 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (80447557)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2016)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2017: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2016: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2015: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 尿酸トランスポーター / 蛍光タンパク質 / 尿酸トランスポーター阻害薬

Outline of Annual Research Achievements

Uricase-HyPer融合タンパク質によるGLUT9輸送評価系の構築
1．GLUT9/Uricase-HyPer共発現細胞株の構築
尿酸トランスポーターGLUT9の哺乳類細胞発現用ベクターはチェコ共和国カレル大学のStiburkova博士より供与を受けた。GLUT9とUricase-HyPerをコードするプラスミドを、アフリカミドリサル腎由来COS-7細胞、あるいはチャイニーズハムスター卵巣由来CHO細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し2日間培養した。GLUT9の発現は逆転写PCR法にて確認し、Uricase-HyPerの発現は蛍光顕微鏡により確認した。結果、チャイニーズハムスター卵巣由来CHO細胞にてGLUT9とUricase-HyPerを共発現する細胞を取得可能である条件を確立することができた。
2．Uricase-HyPer融合タンパク質による尿酸輸送評価
上記で構築した細胞に尿酸を添加し、蛍光プレートリーダーにて30分間の蛍光変化を追跡した。ネガティブコントロールとして、アデニンを添加した細胞も検討した。結果、尿酸添加濃度依存的に蛍光強度比が変化することを確認した。アデニンを添加した細胞、およびHyPerのみを遺伝子導入した細胞ではそのような蛍光変化が見られなかったことから、構築したUricase-HyPer融合タンパク質により、蛍光を指標とした尿酸特異的検出が可能であることを示すことができた。

Research Products

• [Journal Article] Functional analysis of novel allelic variants in URAT1 and GLUT9 causing renal hypouricemia type 1 and 2. (2016)
  • Author(s): Mancikova A, Krylov V, Hurba O, et al
  • Journal Title: Clin Exp Nephrol Volume: 20 Issue: 4 Pages: 578-84
  • DOI: 10.1007/s10157-015-1186-z
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Hereditary Renal Hypouricemia Type 1 and Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. (2015)
  • Author(s): Blanka Stiburkova, Jitka Stekrova, Makiko Nakamura, Kimiyoshi Ichida
  • Journal Title: Am J Med Sci Volume: 350 Issue: 4 Pages: 268-271
  • DOI: 10.1097/maj.0000000000000550
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] <b>The first case of familial Lesch-Nyhan variant in Japan revealed by molecular genetic examination</b> (2015)
  • Author(s): Yasufumi Matsuda, Yasukazu Yamada, Nobuaki Wakamatsu, Miwa Misawa, Katsuya Egawa, Takahiro Yamauchi, Makiko Nakamura, Hiroshi Hasegawa, Kimiyoshi Ichida, Takanori Ueda
  • Journal Title: GOUT AND NUCLEIC ACID METABOLISM Volume: 39 Issue: 2 Pages: 121-128
  • DOI: 10.6032/gnam.39.121
  • NAID: 130005114182
  • ISSN: 1344-9796, 2186-6368
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 痛風・核酸代謝における検査・診断法の進歩 尿酸トランスポーター機能評価法 (2015)
  • Author(s): 中村 真希子, 市田 公美
  • Journal Title: 高尿酸血症と痛風 Volume: 23 Pages: 68-73
• [Presentation] 尿酸トランスポーターABCG2による高尿酸血症治療薬輸送の検討 (2016)
  • Author(s): 中村 真希子, 豊田 優, 髙田 龍平, 長谷川 弘, 市田 公美
  • Organizer: 第49回日本痛風・核酸代謝学会総会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2016-02-18
• [Presentation] 脳内ZMP増加によるAMPK活性化と神経症状発現の関連性に関する検討 (2015)
  • Author(s): 大木 楓奈, 伊藤 祥子, 中島 健裕, 篠原 佳彦, 中村 真希子, 市田 公美
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 尿酸トランスポーターABCG2による高尿酸血症治療薬アロプリノール輸送の検討 (2015)
  • Author(s): 大塚 ひかる, 中村 真希子, 佐藤 慧, 豊田 優, 髙田 龍平, 長谷川 弘, 市田 公美
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] ウリカーゼ融合タンパク質による尿酸トランスポーター機能解析法の開発 (2015)
  • Author(s): 小倉 祥恵, 小林 知加, 中村 真希子, 市田 公美
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 脳内ZMPの増加によるAMPK活性化と神経症状発現の関連性に対する検討 (2015)
  • Author(s): 中村 真希子, 伊藤 祥子, 中島 健裕, 篠原 佳彦, 市田 公美
  • Organizer: 第132回成医会総会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-10-08
• [Presentation] ウリカーゼ融合タンパク質を用いた尿酸トランスポーター阻害薬スクリーニング法の開発 (2015)
  • Author(s): 中村 真希子, 小林 知加, 小倉 祥恵, 市田 公美
  • Organizer: 第10回トランスポーター研究会年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-06-20