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ヒト遺伝子の系統的な機能解析に向けた高効率ジーンターゲティング系の開発

Research Project

Project/Area Number 16012252
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Biological Sciences
Research InstitutionYokohama City University

Principal Investigator

小山 秀機  横浜市立大学, 木原生物学研究所, 教授 (40085626)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 足立 典隆  横浜市立大学, 木原生物学研究所, 助手 (30264675)
Project Period (FY) 2004
Project Status Completed (Fiscal Year 2004)
Budget Amount *help
¥5,000,000 (Direct Cost: ¥5,000,000)
Fiscal Year 2004: ¥5,000,000 (Direct Cost: ¥5,000,000)
Keywordsヒト細胞 / ジーンターゲティング / ノックアウト細胞 / APRT遺伝子 / 突然変異 / 有糸分裂組換え / KU70 / 条件致死変異株
Research Abstract

ヒト細胞からジーンターゲティングによりノックアウト株の作製は、ターゲット効率低く困難である。最近、我々はヒトプレB細胞腫由来のNalm-6株が高いターゲット効率を持つことを見出した。そこで本研究はヒト遺伝子の系統的な機能解析に応用するため、Nalm-6株を用いた高効率ターゲティング系を開発することを目的とする。今年度、常染色体遺伝子変異・有糸分裂組換え系を作製と、増殖必須遺伝子の条件致死変異株の作製を行った。その結果、(1)10種類の遺伝子座のターゲティングを行い、2〜10%の高効率でターゲットクローンを得た。したがって、Nalm-6細胞が高効率のターゲティングが可能な株であることを確認した。(2)16番染色体に座乗するAPRT遺伝子のターゲティングを行い、ヘテロ破壊(APRT+/-)株を得た。この株を用いて、8-アザアデニン耐性でホモ破壊(APRT-/-)細胞の自然突然変異を検出するFluctuation test系をほぼ作製した。(3)変異遺伝子の構造解析のため、APRT遺伝子領域を増幅できるPCR解析系を作製した。また、APRT座にリンクし相同染色体を識別できるミニサテライトマーカーを見出した。(4)一方、DNAの2重鎖切断修復やテロメア維持に働くKU70遺伝子の欠損株を取得するためターゲティングを行い、ヘテロ変異株を得た。ついで、第2のターゲティングを行ったがホモ変異株が得られず、KU70は増殖・生存に必須と思われた。(5)そこで、Tet制御系を用いて条件致死株として分離するため、まずヘテロ変異株にTetベクターを導入した。ついで、Tet応答性ヒトKU70 cDNAベクターを導入し、DOXで発現制御できる株を分離した。この株にKU70ターゲティングを行ったがターゲットクローンを得られず、さらに分離法を検討している。

Report

(1 results)
  • 2004 Annual Research Report
  • Research Products

    (6 results)

All 2005 2004 Other

All Journal Article (6 results)

  • [Journal Article] Genetic interaction between DNA polymerase b and DNA-PKcs in neurogenesis and embryogenesis.2005

    • Author(s)
      Niimi, N.
    • Journal Title

      Cell Death Diff. 12

      Pages: 184-191

    • Related Report
      2004 Annual Research Report
  • [Journal Article] Genetic interactions between BLM and the nonhomologous end-joining pathway in human cells.2004

    • Author(s)
      So, S.
    • Journal Title

      J.Biol.Chem. 279

      Pages: 55433-55442

    • Related Report
      2004 Annual Research Report
  • [Journal Article] p53 deficiency rescues apoptosis but not differentiation in DNA polymerase beta-deficient mice.2004

    • Author(s)
      Sugo, N.
    • Journal Title

      Mol.Cell.Biol. 24

      Pages: 9470-9477

    • Related Report
      2004 Annual Research Report
  • [Journal Article] Loss of nonhomologous end-joining confers camptothecin resistance in DT40 cells : Implications for the repair of topoisomerase I-mediated DNA damage.2004

    • Author(s)
      Adachi, N.
    • Journal Title

      J.Biol.Chem. 279

      Pages: 37343-37348

    • Related Report
      2004 Annual Research Report
  • [Journal Article] Genetic evidence for involvement of two distinct nonhomologous end-joining pathways in repair of topoisomerase II-mediated DNA damage.2004

    • Author(s)
      Adachi, N.
    • Journal Title

      Biochem.Biophys.Res.Commun. 318

      Pages: 856-861

    • Related Report
      2004 Annual Research Report
  • [Journal Article] Evidence for a role of vertebrate Rad52 in the repair of topoisomerase II-mediated DNA damage.

    • Author(s)
      Adachi, N.
    • Journal Title

      DNA Cell Biol. (in press)

    • Related Report
      2004 Annual Research Report

URL: 

Published: 2004-04-01   Modified: 2018-03-28  

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