好熱性藍色細菌のDNAマイクロアレイの開発と生物時計研究への応用

• Project/Area Number: 16013216
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石浦 正寛 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 教授 (20132730)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉山 康雄 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70154507) ; 山田 雅雄 株式会社モリテックス, 研究所長
• Project Period (FY): 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥7,000,000 (Direct Cost: ¥7,000,000); Fiscal Year 2004: ¥7,000,000 (Direct Cost: ¥7,000,000)
• Keywords: DNAマイクロアレイ / オリゴDNA / 好熱性藍色細菌 / 生物時計

Research Abstract

非修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いれば、従来のcDNAマイクロアレイよりも低いコストで性能の良いマイクロアレイを作製することができる。好熱性藍色細菌Thermosynechococcus elongatus BP-1の全遺伝子について最適な配列を持つ45塩基のオリゴヌクレオチドプローブを検索したところ、90%の遺伝子においてそのようなプローブが見つかった。これらのプローブを用いて、2397遺伝子(全遺伝子の95%)を含むマイクロアレイを作製した。T.elongatusのゲノム上に含まれない配列を持つネガティブコントロールプローブでは、非常に低いシグナルしか検出されなかったことから、特異的なハイブリダイゼーションが起こっていることが確認できた。このオリゴヌクレオチドマイクロアレイで得られた測定値の信頼性を評価するために、概日リズム同調2時間後(LL2,主観的昼の初期)および14時間後(LL14,主観的夜の初期)の細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ実験を行った。2枚の独立したマイクロアレイ実験から得られた測定値は非常に似通っており(相関係数0.8以上)、再現性が高いことが示された。20遺伝子についてはノザンブロットによる確認を行い、アレイ実験から得られた結果は正しいことが確認できた(相関係数=0.832)。さらに、LL2とLL14との間で発現量に有意差がある143の遺伝子を同定した。これらは概日発現リズムを示す候補遺伝子であると考えられる。そのうち69遺伝子はLL14で高い発現量が見られ、逆に74遺伝子はLL2に高い発現量を示した。これらの遺伝子の生理機能は多様であり、代謝や転写翻訳、輸送、DNA複製、細胞の増殖などに関連していた。
藍色細菌における概日遺伝子発現ネットワークの解明のために、時計遺伝子KaiCの誘導直後に発現変動を示す遺伝子を作製したオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて同定した。KaiC誘導30分後、1時間後でそれぞれ73遺伝子、33遺伝子が統計的に有意な発現変動を示した。そのなかにはmRNAの転写に重要な役割を担う2つのシグマ因子が含まれており、これらが概日遺伝子発現ネットワークの上流に位置することが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Global Analysis of Circadian Expression in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803. (2005)
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tsuchiya, Y., Nomura, S., Nango, M., Kanehisa, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 187 Pages: 2190-2199
• [Journal Article] 生物時計装置を原子レベルで解明する (2005)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 林史夫, 石浦正寛
  • Journal Title: 蛋白質・核酸・酵素 50 Pages: 111-120
• [Journal Article] Crystal structure of the C-terminal clock-oscillator domain of the cyanobacterial KaiA protein. (2004)
  • Author(s): Uzumaki, T., Fujita, M., Nakatsu, T., Hayashi, F., Shibata, H., Itoh, N., Kato, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Nature Struct.Mol.Biol. 11 Pages: 623-631
• [Journal Article] Circadian rhythms in the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus : compensation of period length over a wide temperature range. (2004)
  • Author(s): Onai, K., Morishita, M., Itoh, S., Okamoto, K., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Bacteriol. 186 Pages: 4972-4977
• [Journal Article] Large-scale screening of Arabidopsis circadian clock mutants by a high-throughput real-time bioluminescence monitoring system. (2004)
  • Author(s): Onai, K., Okamoto, K., Nishimoto, H., Morioka, C., Hirano, M., Kami-ike, N., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant J. 40 Pages: 1-11
• [Journal Article] Determinants of sensitivity and specificity in spotted DNA microarrays with unmodified oligonucleotides. (2004)
  • Author(s): Kucho, K., Yoneda, H., Harada, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. 79 Pages: 189-197
  • NAID: 10014154547
• [Journal Article] Roles of two ATPase-motif-containing domains in cyanobacterial circadian clock protein KaiC. (2004)
  • Author(s): Hayashi, F., Ito, N., Uzumaki, T., Iwase, R., Tsuchiya, Y., Yamakawa, H., Morishita, M., Onai, K., Itoh, S., Ishiura, M.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 279 Pages: 52331-52337
• [Journal Article] Construction of unmodified oligonucleotide-based microarray in the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1. (2004)
  • Author(s): Kucho, K., Tsuchiya, Y., Okumoto, Y., Harada, M., Yamada, M., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. 79 Pages: 319-329
• [Journal Article] 分子装置としての生物時計 (2004)
  • Author(s): 石浦正寛
  • Journal Title: 名大トピックス 139 Pages: 34-35
• [Journal Article] 藍色細菌の時計タンパク質KaiAの構造と機能 機能ドメイン、X線結晶構造解析及び構造-機能相関の解明 (2004)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 中津亨, 加藤博章, 石浦正寛
  • Journal Title: Spring-8 Information 9 Pages: 367-371
• [Journal Article] 藍色細菌の時計タンパク質KaiAの原子構造と時計機能 (2004)
  • Author(s): 宇津巻竜也, 石浦正寛
  • Journal Title: ブレインテクノニュース 105 Pages: 25-29
• [Journal Article] RAP, an integrated program for monitoring bioluminescence and analyzing circadian rhythms in real time.
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ishiura, M
  • Journal Title: Anal Biochem. (印刷中)
• [Journal Article] Identification of novel clock-regulated genes by cDNA macroarray analysis in Chlamydomonas reinhardtii
  • Author(s): Kucho, K., Okamoto, K., Tabata, S., Fukuzawa, H., Ishiura, M.
  • Journal Title: Plant Mol.Biol. (印刷中)
• [Journal Article] Improvement of the bioluminescent reporter system for real-time monitoring of circadian rhythms in the cyanobacterium Synechocystis sp.strain PCC 6803
  • Author(s): Kucho, K., Aoki, K., Itoh, S., Ishiura, M.
  • Journal Title: Genes Genet.Syst. (印刷中)
• [Journal Article] An automated apparatus for the real-time monitoring of bioluminescence in plants
  • Author(s): Okamoto, K., Onai, K., Ezaki, N., Ofuchi, T., Ishiura, M.
  • Journal Title: Anal Biochem. (印刷中)
• [Patent(Industrial Property Rights)] 葉緑体で機能するホタルルシフェラーゼ遺伝子とそれを用いた葉緑体遺伝子発現のリアルタイムモニタリング (2005)
  • Inventor(s): 石浦 正寛, 松尾 拓也, 小内 清
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Number: 2005-029217
  • Filing Date: 2005-02-04
• [Patent(Industrial Property Rights)] 制御プログラム及び培養装置 (2004)
  • Inventor(s): 石浦 正寛, 岡本 和久
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人名古屋大学
  • Industrial Property Number: 2004-380651
  • Filing Date: 2004-12-28