| Budget Amount *help |
¥7,000,000 (Direct Cost: ¥7,000,000)
Fiscal Year 2005: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
Fiscal Year 2004: ¥3,500,000 (Direct Cost: ¥3,500,000)
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| Research Abstract |
今年度は大腸菌における発現系を用いて,リン酸化IRF-3C末端側転写調節ドメイン(pIRF-3 189C)の大量発現を行った.まず目的蛋白質の発現条件の精密化,及び精製条件の最適化により大量かつ高純度に精製する方法を確立した.次にこの試料を用いて結晶化を試みた.結晶化のための初期スクリーニングには市販のGrid screen及びSparse matrixキットを適用したのだが結晶は得られなかった.そこで基本的な沈殿剤,バッファーを広い範囲で検討することで良質な結晶の作製に成功した.pIRF-3 189Cの単結晶は,放射光施設SPring8のビームラインBL41XUにおける測定で良好な回折データを示した.位相の決定には以前に我々が決定した非リン酸化体の結晶構造をモデルとして分子置換法を適用した.さらに分子モデルの構築及び構造の精密化を進め,最終的には1.7オングストロームの高分解能の立体構造を得ることができた.結晶中には非対称単位中に4分子が存在しており,その電子密度から直接リン酸基の位置まで同定することができた.分子間にはリン酸基を介した複数の相互作用が存在していたため,これまでに提唱されてきた機能発現に重要とされるリン酸基を介した相互作用機構については,より慎重な解釈が必要であると考えられる.今後はリン酸化体の結晶構造中に確認されたそれぞれの相互作用と転写活性との関連を明らかにするため,部位特異的変異の導入をはじめとした種々の機能解析を進める予定である.
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