小型魚類を利用した眼形成遺伝子の挿入突然変異法による探索

• Project/Area Number: 16027229
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 蒲池 雄介 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助教授 (90263334)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥5,100,000 (Direct Cost: ¥5,100,000); Fiscal Year 2005: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2004: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
• Keywords: エンハンサートラップ / ゼブラフィッシュ / GAL4 / 遺伝子トラップ

Research Abstract

眼は、複雑な組織間相互作用を通して形成され、その背後には多くの未知の遺伝子の働きがあると考えられる。ゼブラフィッシュは、胚発生の過程でレポーター遺伝子の発現が観察しやすいなど、挿入突然変異法が適用しやすい条件を備えている。本研究は、(1)ゼブラフィッシュにおいて、Sleeping Beauty(SB)トランスポゾンとGAL4/UASシステムを利用した挿入突然変異法(エンハンサートラップ法等)を確立、(2)眼形成過程で機能する遺伝子あるいはエンハンサーをトラップしたと予想される系統を多数見いだし、眼形成の発生システム過程で働く遺伝子の隠された役割を探り出すことを目的に実施した。
まず、GAL4結合部位が種々の蛍光タンパク質遺伝子の上流に配置されたUASレポーター遺伝子を持つトランスジェニックフィッシュ系統を確立した。次に、ゼブラフィッシュ胚での使用に適したGAL4活性化因子を見出すため、様々な転写活性化ドメインを持つGAL4活性化因子を作製した。エンハンサートラップのコンストラクトは、SBトランスポゾンのinverted repeat(IR)の間にプロモーターおよびGAL4活性化因子の配列を挿入して作製した。エンハンサートラップ用のDNAを、SBトランスポーゼースmRNAとともに1細胞期の受精卵に顕微注入し、成魚になるまで飼育したところ、トランスポゾンをF1胚に伝えるファウンダーが、20〜40%の効率で得られた。これらのF0魚を、UASレポーターフィッシュと掛け合わせたところ、特異的な蛍光タンパク質の発現を示すF1胚が、約50%のファウンダーから得られた。以上の結果より、GAL4活性化因子とプロモーターの組み合わせを最適化することで、GAL4/UASシステムを利用したエンハンサートラップがゼブラフィッシュで実現可能であることが分かった。

Research Products

• [Journal Article] Comparative genomic and expression analysis of group B1 sox genes in zebrafish indicates their diversification during vertebrate evolution. (2006)
  • Author(s): Okuda, Y. et al.
  • Journal Title: Developmental Dynamics 235 Pages: 811-825
• [Journal Article] Multiple N-cadherin enhancers identified by systematic functional screening indicate its Group B1 SOX-dependent regulation in neural and placodal development. (2005)
  • Author(s): Matsumata, M et al.
  • Journal Title: Developmental Biology 286 Pages: 601-617
• [Journal Article] Convergence of Wnt and FGF signals in the genesis of posterior neural plate through activation of the Sox2 enhancer N-1. (2005)
  • Author(s): Takemoto T. et al.
  • Journal Title: Development 133 Pages: 297-6
• [Journal Article] Functional analysis of the chicken deltal-crystallin enhancer activity in Drosophila reveals remarkable evolutionary conservation between chicken and fly. (2005)
  • Author(s): Blanco, J. et al.
  • Journal Title: Development 132 Pages: 1895-1905
• [Journal Article] Interplay of SOX and POU factors in regulation of the Nestin gene in neural primordial cells. (2004)
  • Author(s): Tanaka, S. et al.
  • Journal Title: Mol.Cell.Biol. Vol.24 No.20 Pages: 8834-8846
• [Journal Article] Efficient identification of regulatory sequences in the chicken genome by a powerful combination of embryo electroporation and genome comparison. (2004)
  • Author(s): Uchikawa, M. et al.
  • Journal Title: Mech.Dev. Vol.121 No.9 Pages: 145-1158
• [Journal Article] Interplay of Pax6 and SOX2 in lens development as a paradigm of genetic switch mechanisms for cell differentiation. (2004)
  • Author(s): Kondoh et al.
  • Journal Title: Int.J.Dev.Biol. Vol.48 No.8-9 Pages: 819-827