| Project/Area Number |
16041209
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐野 雅己 東京大学, 大学院・理学系研究科, 教授 (40150263)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村山 能宏 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (60334249)
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥14,000,000 (Direct Cost: ¥14,000,000)
Fiscal Year 2005: ¥7,700,000 (Direct Cost: ¥7,700,000)
Fiscal Year 2004: ¥6,300,000 (Direct Cost: ¥6,300,000)
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| Keywords | DNA凝縮転移 / タンパク質フォールディング / AFM(原子間力顕微鏡) / 1分子計測 / たんぱく質フォールディング / レーザーピンセット |
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| Research Abstract |
1.我々はDNA結合色素,YO-PRO2+、YOYO4を用いて、スペルミジン3+(SPD)による凝縮転移下で対イオンの振舞いを調べた。色素とSPDは共に正電荷を持つため、DNAの負電荷に対し対イオンとして振舞う。また、色素はDNAと結合しているときのみ強い蛍光を発する。一定量の色素とDNAを含む溶液に対しSPDを加えると、蛍光強度はSPD濃度の増加にともない単調に減少することを確認した。これはDNAの負電荷を遮蔽する対イオンが、色素からSPDに置換わったことを示している。さらに興味深いことに、あるSPD濃度において蛍光強度の減衰の仕方が大きく変化する。沈降法による測定から、この濃度が凝縮転移濃度に一致することが分かった。得られた理論曲線は測定結果をよく再現した。
2.さらに、光ピンセットを用いた1分子DNAの張力測定により、1分子DNA上におけるYOYO, SPDの対イオン交換を観測することに成功した。YOYOがDNAにインターカレートすると、DNAの見かけの全長が長くなることが知られている。張力測定の結果、YOYOの結合により全長が増加するが、SPDの添加で再度減少することが分かった。全長の減少はYOYOの解離を意味しており、1分子DNA上でYOYO、SPDの対イオン交換が生じていることを示している。
3.原子間力顕微鏡(AFM)を自作し、伸張緩和速度を任意に設定可能にするとともに、力一定(Force clamo)モードや力の増加割合一定(Force ramp)モードなどで動作することを可能にした。このAFMを用いてフォールド過程研究のモデルたんぱく質であるSNase(Staphy lococcal Nuclease)の1分子伸張実験を行った。鋸波状の応答のピーク間隔分布の解析から、引っ張り力が100-400pNの比較的弱い力の範囲では、アンフォールドによる長さ変化が2-6nmの短い構造変化、力が400-600pNの比較的強い力の範囲では、14nm以上の長い構造変化が起こっていることが明らかになった。
4.DNA1分子の伸張実験で観測された3種類の力学応答:WLC,プラトー、鋸波状応答の生成機構を明らかにするため、静電相互作用を考慮したランジュバンダイナミクスモデルを構築し、数値シミュレーションを行った。その結果、静電相互作用を強くするに従い、3種の力学応答が再現されることを確認した。
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