新しい一分子計測法による蛋白質の折り畳みダイナミクス

• Project/Area Number: 16041228
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高橋 聡 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教授 (30283641)
• Project Period (FY): 2004 – 2005
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2005)
• Budget Amount: ¥12,300,000 (Direct Cost: ¥12,300,000); Fiscal Year 2005: ¥6,000,000 (Direct Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2004: ¥6,300,000 (Direct Cost: ¥6,300,000)
• Keywords: 蛋白質折り畳み / 一分子観察 / シトクロムc / 溶液混合装置 / 構造変化 / 蛍光観察

Research Abstract

蛋白質の折り畳みダイナミクスを一分子レベルで観察する新しい手法を開発し、シトクロムcなどの折り畳み過程を解析することが本研究の目的である。本年度は、実験装置の開発とデータ取得条件の最適化を検討した。
1)一分子蛍光観測用光学システムの開発:一分子観測のためのシステムとして、レーザーとイメージインテンシファイアー、CCDカメラによる系を構築した。また、レーザー光を変調することでデータに時間マーカーを入れるためのEO変調素子を導入した。以上の開発により、一分子の蛍光トレースを観測することが可能になった。2)一分子の蛍光観察のための「さや流セル」の開発:一分子レベルの試料を扱うためには、フローセル内面に試料が吸着を起こさずに、一定流速で流れることが必要だった。そのために、セルの中心部分にのみ試料を流すためのさや流セルを開発した。今年度は、ベイバイオサイエンス社(神戸)に依頼し、セルソーターに使われるさや流セルを、特別に我々の実験目的に合うようにデザインした。このセルを用いることで、試料の吸着などの問題をある程度回避できるようになった。3)平衡条件下における折り畳み過程の一分子観測:蛍光ラベルしたシトクロムcを用いて、平衡条件下で折り畳み転移の観察を行った。得られた一分子の蛍光トレースは、様々な強度の間を比較的ゆっくりと行き来した。蛍光強度の頻度分布を計算したところ、集団変性観察から推定されたN、I、U状態に対応する三つのピークが確認された。ピーク分布のグアニジン濃度依存性も、分子集団観察の結果と一致した。従って、今回観察された蛍光強度トレースは、ラベル化試料の特性を正しく反映すると推論できた。以上のように、本研究を行うことで、我々は一分子の蛍光観察にはじめて成功したと考えている。

Research Products

• [Journal Article] Time-Resolved Small Angle X-ray Scattering Investigation on the Folding Dynamics of Heme Oxygenase : Implication of the Scaling Relationship for the Submillisecond Intermediates of Protein Folding. (2006)
  • Author(s): Takanori Uzawa
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 357 Pages: 997-1008
• [Journal Article] Absence of a detectable intermediate in the compound I formation of horseradish peroxidase at ambient temperature. (2005)
  • Author(s): Masato Shintaku
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 280 Pages: 40934-40934
• [Journal Article] Specifically collapsed intermediate in the early stage of the folding of ribonuclease A. (2005)
  • Author(s): Tetsunari Kimura
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 350 Pages: 349-362
• [Journal Article] Specific collapse followed by slow hydrogen-bond formation of beta-sheet in the folding of single-chain monellin. (2005)
  • Author(s): Tetsunari Kimura
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102 Pages: 2748-2753
• [Journal Article] Stereospecific amyloid fibril formation of a peptide fragment of β2-microglobulin. (2005)
  • Author(s): Hiromasa Wadai
  • Journal Title: Biochemistry 44 Pages: 157-164
• [Journal Article] NMR characterization of refolding of β2-microglobulin trapped by prolyl cis-trans isomerization. (2005)
  • Author(s): Atsushi Kameda
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 348 Pages: 383-397
• [Journal Article] Seeding-dependent propagation versus maturation of amyloid fibril conformation. (2005)
  • Author(s): Keiichi Yamaguchi
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 352 Pages: 952-960
• [Journal Article] Specific collapse followed by slow hydrogen-bond formation of β-sheet in the folding of single-chain monellin. (2005)
  • Author(s): Tetsunari, Kimura et al.
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 Pages: 2748-2753
• [Journal Article] Stereospecific amyloid-like fibril formation by a peptide fragment of β2-microglobulin. (2005)
  • Author(s): Hiromasa, Wadai et al.
  • Journal Title: Biochemistry 44 Pages: 157-164
• [Journal Article] No reduction by nitric-oxide reductase from denitrifying bacterium Pseudomonas aeruginosa: characterization of reaction intermediates that appear in the single turnover cycle. (2004)
  • Author(s): Hideyuki, Kumita et al.
  • Journal Title: J Biol Chem. 279 Pages: 55247-55254
• [Journal Article] Steric effects of isoleucine 107 on heme reorientation reaction in human myoglobin. (2004)
  • Author(s): Haruto, Ishikawa et al.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. 324 Pages: 1095-1100
• [Journal Article] Structural and functional characterization of "laboratory evolved" cytochrome P450cam mutants showing enhanced naphthalene oxygenation activity. (2004)
  • Author(s): Koji, Matsuura et al.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. 323 Pages: 1209-1215
• [Journal Article] Direct observation of Aβ amyloid fibril growth and inhibition (2004)
  • Author(s): Tadato, Ban et al.
  • Journal Title: J.Mol.Biol. 344 Pages: 757-767